金黄色葡萄球菌对喹诺酮类药物耐药研究进展 *

刘 敏，刘秀芬，于 慧 综述,王占黎,△审校

1.内蒙古自治区包头医学院公共卫生学院，内蒙古包头 014040；2.内蒙古自治区疾病相关生物标志物重点实验室，内蒙古包头 014030

喹诺酮类抗菌药物具有广谱活性和多种临床适应证，口服吸收和组织渗透良好，在人体中的药代动力学参数优良，在治疗多种感染中具有较高的临床效力，成为了世界上应用最广泛的抗菌药物之一。随着喹诺酮类药物在临床上大范围、不规范地使用，金黄色葡萄球菌(以下简称“金葡菌”)耐药问题越来越严重。为有效解决这一问题，本文从金葡菌的耐药现状、耐药机制及应对措施等方面进行综述和展望。

1 耐药现状

金葡菌是临床最常见的革兰阳性菌，具有多种毒力因子，并具有对大多数抗菌药物产生耐药性的能力。近年来，由于抗菌药物的滥用，导致金葡菌耐药情况严峻，有研究发现耐甲氧西林金葡菌(MRSA)不仅对β-内酰胺类抗菌药物耐药，而且对喹诺酮类同样具有耐药性[1-2]。据中国细菌耐药监测网(CHINET)2018年对全国44所三级甲等医院监测结果显示，MRSA对喹诺酮类药物中的环丙沙星耐药率为36.7%，对左氧氟沙星耐药率高达41.3%，MRSA平均检出率为34.0%，同时监测结果显示MRSA对喹诺酮类抗菌药物耐药程度远远高于甲氧西林敏感金葡菌(MSSA)。统计调查显示[3-4]，孟加拉国2004年至2018年期间金葡菌对环丙沙星的耐药率高达41.4%～68.3%。埃塞俄比亚2015-2018年金葡菌对环丙沙星耐药率为13.5%～23.7%。

2 药物发展史及作用机制

喹诺酮类抗菌药物的开发历史源于1962年科学家开发的萘啶酸(NA)，由此诞生第1代喹诺酮类药物，但由于其仅具有对革兰阴性菌的适度活性且口服吸收率低，所以仅用于治疗单纯性尿路感染[5]。此后直至20世纪70年代，一系列第2代喹诺酮类药物相继被开发问世，最具代表的是吡哌酸(PPA)，PPA将哌嗪基团引入作为喹诺酮核的C7位的碱性部分。与第1代相比，药物的活性谱范围广得多，药代动力学得到改善，改善了对革兰阴性菌的活性，使抗菌谱扩大并包括铜绿假单胞菌。此外，PPA基本的哌嗪环，可以与C3位的羧酸形成两性离子，增加药物渗透细菌细胞的能力，从而提高对革兰阳性菌的活性。20世纪80年代初，通过支架药物设计和基本侧链突破的第一个氟喹诺酮类药物诺氟沙星(NFLX)成为第3代喹诺酮类药物的代表，NFLX是一种六氟化喹诺酮，在C7位具有哌嗪基，与以往喹诺酮类药物有显著的差异，其抗菌谱更广且具有更强的杀菌及细胞穿透能力[6]，在治疗多种感染方面具有很高的临床疗效。20世纪90年代至今，以莫西沙星、氨氟沙星等为代表的第4代喹诺酮类药物在原有基础上，提高了抗厌氧菌活性以及对光的耐受性，其抗菌效果及抗菌谱均有所增加。目前，奥泽沙星、非那沙星等新开发的喹诺酮类药物被证实在pH值降低的环境下对包括耐喹诺酮类药物的MRSA在内的7类菌株具有较强的抗菌活性[7]。

研究表明喹诺酮类药物通过破坏细菌DNA合成过程中具有解旋作用的拓扑异构酶Ⅱ型酶(即DNA促旋酶和拓扑异构酶Ⅳ)的活性来阻断DNA复制以达到抑菌的效果。前者有A、B两个亚单位，A-亚单位在合成过程中切开染色体DNA一条后链从而形成切口，B-亚单位催化产生ATP使DNA前链后移，A-亚单位再将切口封闭形成负超螺旋结构。喹诺酮类药物通过非碱基配对的方式与A-亚单位结合，使DNA超螺旋结构不能封口，单链暴露，细菌染色体出现不可逆损伤，进而致使细菌死亡[8]。后者为解链酶，是喹诺酮类药物作用于金葡菌的主要细胞毒性靶标，药物与之结合形成喹诺酮类药物-DNA-拓扑异构酶三元复合物，阻断细菌DNA复制，从而起到杀菌作用。

3 耐药机制

3.1药物靶酶及编码基因的突变 两种药物靶酶分别由gyr A、gyr B和grl A、grl B基因编码。通常由于靶酶中的gyr A和grl A基因局部结构域中产生一种或两种的抗性突变，致使药物与酶-DNA复合物的结合能力降低，不能有效切断金葡菌DNA的复制和转录过程，进而导致耐药的产生。SANFILIPPO等[9]研究显示突变主要位于酶的gyrA或grlA的氨基末端结构域上。徐洁等[10]关于金葡菌对环丙沙星耐药与gyr A、grl A基因突变相关性的研究显示gyr A和grl A突变是金葡菌对环丙沙星耐药的重要原因，同时研究表明当gyr A和grl A同时发生多点突变时，则会导致菌株高水平耐药。有研究显示喹诺酮类药物对金葡菌作用的首要靶酶是拓扑异构酶Ⅳ[11]，其grl A基因最为常见的突变位点是Ser-80→Phe和Glu-84→Lys。也有研究发现一些对喹诺酮类药物耐药的金葡菌株中存在grl B和gyr B基因突变，但仅在gyr A和grl A发生突变的情况下出现[12]，故这些突变与菌株耐药性的关系尚不明确。

3.2外排泵基因的过度表达 金葡菌无外膜及膜孔蛋白，其摄入喹诺酮类药物的主要方式是脂质膜的简单扩散，因此有效的外向转运蛋白是降低细胞药物浓度的主要手段。研究显示Nor A、Nor B和Nor C外排泵的过表达是导致药物在菌体内累积浓度过低的主要原因[13-14]。Nor A外排泵是由Nor A蛋白介导，其编码基因nor A普遍存在于金葡菌染色体中，属于内源性结构基因。研究显示[13]当细胞环境中喹诺酮类药物长期反复存在时，可使nor A基因表达过度，进而致使Nor A蛋白表达明显增强，外排功能增加，导致如诺氟沙星、环丙沙星等亲水性喹诺酮类药物在菌体内蓄积量过少而产生耐药性。Nor B外排泵是由nor B基因编码的一个分子质量约为49 ku的蛋白质，当 Nor B过表达时可将诺氟沙星和环丙沙星泵出，除此之外，它还可以识别莫西沙星和司帕沙星导致这两种抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC)值增加。Nor C外排泵与NorB具有基本同源性，其外排作用由Nor C蛋白介导。研究证实[14]nor C基因过度表达可使诺氟沙星和莫西沙星的MIC值增加四倍，环丙沙星和司帕沙星的MIC值增加两倍，从而导致菌体对喹诺酮类药物产生一定程度耐药。

3.3质粒介导的耐药 质粒介导的喹诺酮耐药性(PMQR)发现相对较晚。目前已经发现的PMQR机制有三种：第一种是喹诺酮抗性蛋白基因家族(qnr)。qnr基因编码的Qnr蛋白可优先结合到靶酶上，使药物结合位点构象改变从而不能有效地与之结合，保护细菌免受药物的攻击。同时还通过减少染色体靶酶数量来避免细菌被药物抑制[15]。第二种是氨基糖苷乙酰转移酶[aac(6′)-Ib-cr]。它是由Trp-102→Arg和Asp-179→Tyr突变产生的衍生物，对卡那霉素、妥布霉素等氨基糖苷有活性，同时也能够在哌嗪基环上用氨基氮将氟喹诺酮类药物乙酰化[16]。第三种是质粒介导外排泵(Qep A和Oqx AB)。QepA可降低亲水性氟喹诺酮类药物的易感性，特别是环丙沙星和诺氟沙星。OqxAB可介导低水平的喹诺酮耐药，同时还可帮助细菌在低浓度的喹诺酮下存活，进而促进细菌向高水平耐药发展[17]。据目前检测报道显示携带Oqx AB基因主要是肠杆菌科，尚未在革兰阳性菌株中发现该基因。王丽华等[18]在动物源金葡菌中首次发现质粒介导的喹诺酮类耐药基因qnrS1、qnrD、aac(6′)-Ib-cr和oqxA，同时说明耐药基因可在不同菌种之间传播，加大控制菌株耐药传播的难度。

4 应对措施

喹诺酮类药物作为继头孢菌素类药物之后临床使用最广泛的抗菌药物之一，在治疗感染性疾病中发挥了巨大的作用。据统计，目前全球使用过喹诺酮疗法的患者超10亿人次。但过量使用抗菌药物是耐药性的主要驱动力，随着喹诺酮类药物的大量使用，金葡菌对喹诺酮类药物的耐药情况严重，因此寻求有效途径控制细菌耐药性是我们一直在解决的全球问题。

4.1合理使用抗菌药物 合理使用抗菌药物无疑是最根本的解决途径，可通过制订和落实抗菌药物临床管理规范及相关政策来控制抗菌药物的使用量进而遏制细菌耐药性的产生。2011年卫生部在全国范围内发起合理使用抗菌药物运动，并于2012年颁布实施了包括抗菌药物选择、采购、使用及监测等在内的综合性法规《抗菌药物临床应用管理办法》，同时更新了公立医院临床实践中抗菌药物使用的国家指南，有效地降低了公立医院的抗菌药物使用量及患者的医疗负担，但在基层医疗机构和县级医院并未产生明确的效果。在对全国抗菌药物管理行动的评估结果显示65家公立医院住院和门诊患者的抗菌药物处方率分别从62.9%和26.4%降低至35.3%和12.9%[19]，抗菌药物的使用密度从76.6 DDD/100床日降低至35.9 DDD/100床日，患者的抗菌药物费用显著降低。此外有研究显示[20]我国某三级医院总抗菌药物使用密度由2014年的50.66 DDD/100床下降到2018年的44.28 DDD/100床，同时表明抗菌药物使用率与耐药性存在正相关关系。

4.2研发新药 研发新型药物亦是控制金葡菌的有效途径之一。近年来，大批新型喹诺酮类药物相继问世，如德拉沙星作为新型氟喹诺酮类药物对金葡菌具有较强的抗菌活性，已于2017年6月批准上市[21]；苹果酸奈诺沙星是TaiGen生物技术公司研发的新型不含氟的喹诺酮类药物，研究显示对金葡菌具有抗菌活性，已于2016年6月批准上市[22]；新型非氟化喹诺酮类药物奥泽沙星被证实对耐那地沙星或左氧氟沙星的MRSA保持有效的抗菌活性，于2017年12月获得美国FDA批准上市。除此之外，中药治疗由于安全性高、成本低成为对抗耐药菌株的新思路，复方黄连制剂对耐药金葡菌的gyr A基因突变具有回复突变作用。实验证明黄芩提取物、香青兰乙酸乙酯提取物对多重耐药金葡菌具有良好的抑菌作用[23-24]。REUVEN等[25]证实金缕梅和绿茶提取物具有抗金葡菌的作用，且二者组合可增强其抗菌作用。

4.3联合用药 使用两种或两种以上抗菌药物可以利用多种抗菌机制的相加或协同作用有效抑制细菌对喹诺酮类药物产生耐药性。同时，带有辅助剂的抗菌药物也可以有效抑制耐药菌株，因为辅助剂可以增加抗菌药物对目标物的接触[26]。NASTARAN等[27]经实验证明Fe3O4@Ag纳米复合材料可以作为一种有效的药物耐药抑制剂。Fe3O4@Ag纳米复合材料与抗菌药物在降低MIC方面具有协同作用，同时在该纳米复合材料存在的情况下，norA和norB基因的表达较对照降低了两倍以上。PEDRO等[28]研究发现噻唑(NJ)16和NJ17联合诺氟沙星能够完全恢复诺氟沙星对耐药金葡菌的抗菌活性。ABD EL-BAKY等[29]研究发现酮康唑对金葡菌无抑菌作用，但与左氧氟沙星联用可通过体外抑制外排泵和生物膜的形成来抑制norA基因表达，进而增强氟喹诺酮类药物对多重耐药金葡菌的抗菌活性。研究显示菘蓝、黄芩与环丙沙星联合使用可产生协同作用有效对抗金葡菌，苋菜提取物具有抑制耐喹诺酮类药物的金葡菌norA外排泵过表达的作用，可作诺氟沙星的活性增强剂用于对抗耐氟喹诺酮金葡菌引起的感染[30]。

5 展 望

抗菌药物的非理性使用致使金葡菌对喹诺酮类药物耐药形势严峻。近年来，随着卫生系统改革的不断深入，我国抗菌药物管理工作取得一定成效，有效地降低了公立医院抗菌药物的使用率，但对于基层医疗机构和县级医院效果甚微，仍应进一步规范抗菌药物的临床使用。此外，探索新型抗菌药物同样至关重要，越来越多的草本植物被证实具有抗菌作用，但对其作用机制尚未明确不能有效地应用于临床，因此，仍需进一步深入研究和探索。