哈萨克族食管癌组织中miR-143、miR-145和Survivin m RNA的表达及其临床病理意义

封 敏，艾比拜·莫合塔尔，石静怡，祖可来·艾力江，李永祥，闫长顺，李秀梅

(1．新疆医科大学附属肿瘤医院，新疆 乌鲁木齐830011；2．新疆医科大学临床医学专业，新疆 乌鲁木齐 830011；3．新疆医科大学基础医学院，新疆 乌鲁木齐 830011)

2012年全球肿瘤统计数据(GLOBOCAN 2012)显示食管癌(esophageal cancer，EC)是目前世界上常见恶性肿瘤之一，其死亡率位居所有癌症原因死亡率的第6位，5年生存率仅为15%～25%[1]。食管癌的患病率因地区变化而显著不同，在新疆，哈萨克族居民食管癌发病率(155.9/10万)明显高于其他少数民族[2]。小分子核糖核酸(microRNA，miRNA)是一类具有组织特异性或发育阶段特异性表达特征的非编码调控的小RNA，在动植物基因组中，已发现存在大量簇生排列的MIR基因，常位于一个多顺反子内，称为MIR基因簇，其通过共表达影响胚胎生长发育、细胞周期和细胞分化等诸多方面，MIR143/145基因簇同位于染色体5q32位点上，是目前发现的一对具有重要生物学功能的MIR基因簇[3]。

Survivin是目前发现最强的凋亡抑制因子，其表达上调在众多肿瘤发生中是一个早期事件，高表达Survivin的抗凋亡、促增殖作用在肿瘤发生发展中发挥重要作用。而miR-143、miR-145是我们前期采用microRNA芯片筛查出的在食管癌组织和癌旁组织中差异表达的microRNA，靶基因预测软件显示Survivin是miR-143的靶基因，但三者之间的关系在恶性肿瘤中研究较少，在哈萨克族食管癌中的研究未见报道，故本文采用荧光定量PCR方法检测47例新疆哈萨克族食管癌组织及癌旁组织中miR-143、miR-145和Survivin mRNA的表达情况，分析其与哈萨克族食管癌临床生物学行为的关系，对进一步了解哈萨克族食管癌发病机制具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 临床资料

47例新疆哈萨克族食管癌组织及癌旁组织组织均取自2016—2018年新疆医科大学附属肿瘤医院手术切除标本，患者术前均未接受放化疗，手术中取材后迅速将标本置于液氮中，并于-80℃冰箱中贮存。病理切片均诊断为鳞状上皮细胞癌，男性30例，女性17例。肿瘤按国际TNM分期(UICC，2009年)，Ⅰ期2例，Ⅱ期17例，Ⅲ期29例；有淋巴结转移30例，无淋巴结转移17例；低分化28例，中高分化19例。

1.2 试剂和引物

miScript II RT Kit、miScript SYBR Green PCR Kit、RT-PCR引物，均购于北京天根公司；RNA提取试剂Trizol购于Promega公司。引物序列如下：miR-143， 上 游 5′-GAGCTACAGTGCTTC-3′， miR-145，上游 5′-GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU-3′，U6，上游 CTCGCTTCGGCAGCACA；Survivin，上游5′-TCTGGAGGTCATCTCGGCTGTTC-3′，下游 5′-TC CTCACTGCGGCTGTCTGG-3′；GAPDH，上游 5′-TC TGGAGGTCATCTCGGCTGTTC-3′，下 游 5′-TCCTCA CTGCGGCTGTCTGG-3′。

1.3 组织总RNA提取、逆转录及荧光定量PCR

采用Trizol试剂一步法提取总RNA，紫外分光光度计测定其纯度。以提取的RNA为模板，按miScript II RT Kit逆转录试剂盒说明书进行逆转录。以得到的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR扩增反应体积为20 μL，反应条件：94℃、2 min；94℃、20 s，60℃、30 s，72℃、30 s，40个循环；72℃、5 min，扩增反应结束后进行。

1.4 统计学分析

数据采用 2-ΔΔCT法进行分析，SPSS 16.0统计软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差表示；miR-143、miR-145、Survivin mRNA在哈萨克族食管癌组织和癌旁组织中表达水平的比较采用t检验；miR-143、miR-145、Survivin mRNA与哈萨克族食管癌临床病理指标关系的分析采用t检验，Spearsman双变量相关性分析，以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 肿瘤组织中miR-143、miR-145、Survivin mRNA的表达

47例哈萨克族食管癌组织及癌旁组织中荧光定量PCR检测结果见图1，显示与癌旁组织比较，肿瘤组织中miR-143、miR-145的相对表达水平均明显下调，肿瘤组织中miR-143相对表达水平(0.31±0.08)约为癌旁组织的1/3，miR-145的相对表达水平(0.43±0.18)约为癌旁组织的1/2。与癌旁组织比较，肿瘤组织中Survivin mRNA的相对表达水平(3.67±0.56)升高(P＜0.01)。

图1 哈萨克族食管癌组织及癌旁组织中miR-143、miR-145、Survivin mRNA的相对表达水平

2.2 哈萨克族食管癌组织中miR-143、miR-145、Survivin mRNA表达与临床病理指标的关系

低分化、淋巴结转移的食管癌组织及Ⅱb～Ⅲ期的肿瘤组织中miR-143相对表达水平分别低于高分化、淋巴结未转移及Ⅰ～Ⅱa期的肿瘤组织；而miR-145在低分化及淋巴转移的肿瘤组织中的表达分别低于高分化及淋巴结未转移的肿瘤组织，差异均有统计学意义；淋巴结转移及Ⅱb～Ⅲ期的肿瘤组织中Survivin mRNA的表达分别高于淋巴结未转移及Ⅰ～Ⅱa期的肿瘤组织，差异均有统计学意义。见表1。

表1 食管癌组织中miR-143、miR-145、Survivin mRNA的表达与临床病理指标的关系

2.3 miR-143、miR-145、Survivin mRNA相关性分析

Spearman相关分析显示在哈萨克族食管癌组织中miR-143与miR-145的表达呈正相关(r=0.662，P=0.000)，miR-143与Survivin mRNA的表达负相关(r=-0.313，P=0.002)。

3 讨论

食管癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，在我国食管癌的发病率具有明显的地域性和民族特异性，在新疆，哈萨克族食管癌发病率最高，目前早发现、早治疗是提高食管癌患者五年生存率的有效方法，因此，寻找食管癌早期诊断和预后标志物有重要意义。MIR基因簇通常定位于染色体的特殊区域，是MIR家族中的各成员紧密成簇排列成大串的重复单位，同属于同一个祖先的基因扩增产物。MIR143/145是目前公认的一对基因簇，在结构上均不编码蛋白，不含开放阅读框，同位于人类的第5号染色体，具体位置分别在5：148808481-148808586 和 5： 148810209-148810296，在功能上发挥类似的作用[4]。研究显示在食管鳞状细胞癌、肝癌等消化道肿瘤中miR-143和miR-145表达下调，且与细胞分化、肿瘤侵袭深度相关，体外划痕实验也证实，上调miR-143和miR-145表达可以显著抑制食管癌细胞的迁移及细胞增殖，在食管癌发生发展中可能发挥抑癌作用[5-6]。而新疆哈萨克族食管癌组织中miR-143和miR-145的表达未见文献报道，故本实验联合检测了47哈萨克食管癌组织及癌旁组织中miR-143和miR-145的表达，实验结果显示，哈萨克族食管癌组织中的miR-143和miR-145表达水平显著低于远端无癌组织，其中miR-143表达水平下调更明显，仅为癌旁组织水平1/3，miR-143和miR-145表达正相关，病理因素分析显示在低分化及淋巴转移的哈萨克族食管癌组织中miR-143和miR-145表达显著低于高分化及淋巴未转移的肿瘤组织，另外miR-143低表达还与临床分期相关，随着临床病程的进展，miR-143呈现持续低表达，本次实验结果提示在哈萨克族食管癌发生发展中miR-143和miR-145共同低表达，在哈萨克族食管癌的发生发展中可能发挥协同效应，且MIR143/145基因簇的低表达更有利于食管癌细胞增殖及侵袭转移。目前大量研究显示miR-143和miR-145在肺癌、胃癌、胶质瘤、卵巢癌、乳腺癌等多种肿瘤中呈低表达[7]，通过抑制下游靶基因的表达调节细胞增殖、侵袭和转移、血管生成及肿瘤药物的敏感性[8-13]，47例哈萨克族食管癌组织中miR-143和miR-145表达下调，结果与我们前期MIR基因芯片结果相一致，同时也与文献报道的结果基本相符，但在哈萨克族食管癌中MIR143/145基因簇的协同作用机制尚需进一步研究。

Survivin是人类凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein family，IAP)家族中的分子量最小、凋亡抑制作用最强的凋亡抑制因子之一，也是我们前期在大量哈萨克族食管癌组织标本中筛查出显著差异表达的基因[14-15]，在哈萨克族食管癌组织中表达明显上调，且与淋巴结转移、临床分期的相关，Survivin高表达可以直接抑制Caspase-3和Caspase-7的活性从而抑制细胞凋亡，其次还可以间接地与细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4形成复合物，释放出p21/CDK4复合体中的p21，从而直接抑制Caspase-3前体的激活，致使凋亡小体不能形成，阻断细胞的凋亡过程[16-17]。曾剑等[18]实验也证实Survivin表达阳性的食管癌更易发生淋巴结转移，恶性程度更高，本实验结果与其基本一致，提示在新疆哈萨克族食管癌的发展中Survivin高表达参与了食管癌的进展及侵袭转移的过程，可以作为评估食管癌恶性程度及转移的生物学指标。

MIR生物学信息学靶标预测软件(包括PicTar、miRanda和TargetScan)高度提示Survivin是MIR143/145基因簇的靶基因，故本实验采用Spearman相关性分析显示在47例哈萨克族食管癌组织标本中miR143低表达、Survivin mRNA高表达呈负相关，但miR-145的表达水平与Survivin mRNA的表达无明显相关，我们推测在哈萨克族食管组织中miR-143和miR-145表达下调，作为一对基因簇发挥协同作用，低表达的miR143直接或间接导致Survivin mRNA高表达，从而促进食管癌细胞发生侵袭转移，但在此过程中MIR143/145基因簇发挥协同效应中谁占主导地位，其与Survivin之间具体的调控机制未见相关文献报道，我们将在后续的体外细胞试验中进一步研究。

食管癌的发生是一系列内外因素共同发挥效应的综合结果，多种microRNA和多种基因在其发生发展中发挥了重要作用，而新疆哈萨克族食管癌高发，且预后差，五年生存率低，故寻求特异性高、灵敏的分子标志物作为食管癌的早期诊断指标具有重要意义。MIR143/145基因簇低表达与Survivin高表达共同发挥作用参与了哈萨克族食管癌的侵袭转移过程，系统研究三者之间的关系有助于揭示在肿瘤发生发展中miRNA基因簇在肿瘤网络调控中的作用。