新疆哈萨克族食管癌与正常组织间差异表达miRNA的筛查及验证

马莉莉，张树丽，李 琴，许 彭，封 敏，李秀梅，

(1．新疆医科大学第五附属医院，新疆 乌鲁木齐 830011；2．新疆医科大学第一附属医院，新疆 乌鲁木齐 830011；3．新疆医科大学基础医学院，新疆 乌鲁木齐 830011；4．新疆医科大学附属肿瘤医院，新疆 乌鲁木齐 830011)

作为非编码RNA(non-coding RNA)家族新成员之一的miRNA是一类长度为21～23个核苷酸的调控性小RNA分子，存在于多种生物基因组内。它可通过mRNA剪切和抑制蛋白质翻译的方式调控靶基因，调节约50%的蛋白编码基因。研究发现[1-2]，miRNA与相应的蛋白结合后参与转录后基因调控，发挥癌基因或抑癌基因的作用，参与细胞增殖、分化、凋亡等多种病理过程，它的表达失控与肿瘤发生密切相关，引起包括其调控的靶基因以及相关的重要信号通路组成的调控网络发生异常，从而促进肿瘤的发生或进展。因此，研究肿瘤发生相关miRNA的表达及功能是当今肿瘤发生机制研究热点之一。miRNA基因芯片具有高效率、高通量特点，已作为重要的技术应用于疾病发生的研究领域。食管癌作为严重危害人类健康的恶性肿瘤之一，死亡率高，生存率低，发生机制仍在摸索中[3]。本研究采用miRNA表达谱基因芯片方法筛选新疆哈萨克族食管癌组织与远端正常组织中差异表达的miRNAs后，选取部分差异表达的miRNAs在47例新疆哈萨克族食管癌组织与远端正常组织中进行实时荧光定量PCR验证，分析miRNAs表达与食管癌临床病理指标的关系，为今后进一步研究食管癌发生的机制及治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 病例标本

收集2016—2018年新疆医科大学附属肿瘤医院手术切除的新疆哈萨克族食管癌组织及远端正常组织47对。组织病理切片均诊断为食管鳞状上皮细胞癌，男性30例，女性17例。所有患者均具备完整的病理资料，并术前未接受放化疗。所有标本取材后迅速置于-80℃冰箱保存。按国际TNM手术病理分期标准(UICC，2009年)：Ⅰ期1例，Ⅱ期17例，Ⅲ期29例；有淋巴结转移30例，无淋巴结转移17例；低分化28例，高分化19例。

1.2 基因芯片与试剂

miRNA表达谱基因芯片为由北京博奥生物有限公司提供的Agilent基因芯片。Trizol试剂(Promega公司)，miScript II RT Kit，miScript SYBR Green PCR Kit，以及所有引物均购自北京天根生物有限公司。引物序列见表1。

1.3 miRNA表达谱基因芯片检测及高通量筛选

将提取的组织总RNA进行靶标制备，芯片杂交，使用Agilent芯片扫描仪(G2565CA)对芯片进行扫描，得到杂交图片。应用miRNA芯片分析系统(Agilent Feature Extraction v10.7，Agilent Gene Spring软件)P-value方法对基因芯片杂交结果进行分析。按如下标准筛选差异表达miRNA：log2|变化倍数|≥6为上调；log2|变化倍数|≤-2为下调。

表1 miRNA引物序列

1.4 荧光定量PCR反应

采用Trizol试剂一步法提取组织总RNA，并用紫外分光光度计测定纯度：RNA溶液D(260)/D(280)比值介于1.8～2.0之间为合格。按照miScript II RT Kit反转录试剂盒说明书进行操作，以提取的RNA为模板反转录成cDNA。用得到的cDNA为模板进行实时聚合酶链反应。每个标本都用U6做内参照，反应体积20μL，反应条件：94℃、2 min；94℃、20 s，60℃、30 s，72℃、30 s，40个循环；72℃退火5 min。

1.5 统计学处理

采用 2-ΔΔCT相对定量法对实时聚合酶链反应中基因表达的相对变化进行分析，采用SPSS 16.0统计软件包对miRNAs在癌组织和远端正常组织的相对表达量进行t检验，不同临床病理指标分组中miRNAs相对表达量进行t检验，miRNAs表达与食管癌临床病理指标的关系进行Spearsman双变量相关性分析方法，以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 基因芯片筛选出差异表达的miRNAs

采用Agilent Gene Spring分析软件(Agilent Feature Extraction v10.7)对新疆哈萨克族食管癌组织及癌旁组织原始芯片数据进行分析，筛查出不同表达水平的miRNA(见图1)。筛选出61个满足条件的miRNAs，其中42个miRNA表达上调，19个miRNA表达下调(见表2)。

2.2 差异表达的miRNAs在哈萨克族食管癌组织及远端正常组织中表达分析

在47例食管癌组织中对miR-21、miR-132、miR-130b、miR-141、miR-143、miR-133b、miR-195、miR-140等8个消化道肿瘤相关的miRNA进行实时荧光定量PCR检测，实验结果显示：与远端正常组织相比，哈萨克族食管癌组织中miR-21、miR-132、miR-130b的表达水平显著升高；miR-141、miR-143、miR-133b、miR-195表达水平显著降低；miR-140表达变化无统计学意义；实时荧光定量PCR检测的 miR-21、miR-132、miR-130b、miR-141、miR-143、miR-133b、miR-195表达水平与Agilent miRNA基因芯片结果一致，荧光定量PCR检测的miR-140表达水平与Agilent miRNA基因芯片结果不一致(见表3、图2)。

图1 microRNA表达谱分析

表2 差异表达的miRNAs

表3 miRNAs在47例哈萨克族食管癌组织及远端正常组织中表达

图2 miRNAs在47例哈萨克族食管癌组织中表达

2.3 miRNAs表达与食管癌临床病理指标的关系

中低分化的食管癌组织中miR-21、miR-141表达水平高于低分化组，miR-143、miR-133b的表达显著低于高分化的肿瘤组织；随着病程发展，与Ⅰ～Ⅱa相比，Ⅱb～Ⅲ分期中的miR-21、miR-132表达水平明显上调，miR-143的表达水平显著下调；在淋巴侵袭转移的食管癌组织中miR-21、miR-132表达水平增高，而miR-143、miR-133b的表达水平明显降低(见表4)。

表4 哈萨克族食管癌组织中miRNAs的相对表达水平与病理指标的关系

3 讨论

肿瘤的发生转移是多基因表达失调及多因素共同作用的结果，大量研究证实[4]miRNAs与肿瘤的发生发展密切相关，在肿瘤初期虽然缺乏明显的早期临床表现，但可能相关的miRNAs表达水平却已经发生异常，根据miRNA功能大致可以分为抑癌性和致癌性miRNA两类，他们分别原癌基因、抑癌基因相互作发挥效应，所以探究肿瘤的发生发展与相关miRNAs之间的关系，寻找差异表达的miRNA，为进一步深入研究其在肿瘤中的确切机制具有重要的意义。

miR-21、miR-132、miR-130b、miR-141、miR-143、miR-133b、miR-195、miR-140等8个miRNA是我们前期采用基因芯片筛查出的部分差异表达的miRNAs，荧光定量PCR检测结果证实除miR-140在肿瘤组织中表达下调无统计学差异外，其余7个miRNAs在47例哈萨克族食管癌组织中出现表达上调和下调，检测结果与基因芯片一致，提示哈萨克食管癌发生发展是多个miRNA表达失调共同作用的结果，miRNA表达异常通过调控相应的原癌基因、抑癌基因及不同的信号传导通路调控着肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭转移的过程。

在47例哈萨克族食管癌组织中miR-21、miR-132表达显著升高，且在中低分化的肿瘤组织中miR-21表达明显上调，提示在哈萨克族食管癌组织中miR-21高表达可能与细胞分化调控有关。在中晚期Ⅱb～Ⅲ临床分期及有淋巴转移的肿瘤组织中miR-132明显高表达，提示miR-132高表达可能与肿瘤细胞生长侵袭有关。miR-21在正常组织中几乎不表达或表达很低，在肿瘤中miR-21常见性的表达失控上调[5]，有研究证实通过多因素分析发现食管鳞状细胞癌患者的血浆miR-21水平高表达，上调食管癌细胞及肝癌细胞中miR-21表达水平可显著促进肿瘤细胞增殖和迁移，并抑制肿瘤细胞凋亡，其机制可能与PI3K/Akt及ERK信号传导通路有关[6-7]。本实验中哈萨克族食管癌组织中miR-21高表达与以往研究结果相符，提示高表达的miR-21在哈萨克族食管癌细胞增殖及侵袭转移中发挥致癌基因的作用。目前研究证实miR-132的失调与前列腺癌、胃癌、肝癌、非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤的发生紧密相关，Li等[8]研究表明在前列腺癌中miR-132高表达可导致p27、p21、E2F5下调抑制细胞凋亡，促进前列腺癌的发生。在胃癌患者及胶质瘤患者血清中miR-132高表达，且可作为预测预后的独立分子标记物[9-10]。但也有文献报道miR-132在卵巢癌等肿瘤中低表达，发挥抑癌基因的作用[11]。我们查阅了大量文献发现目前miR-132在肿瘤中的表达及作用分子信号机制存在较大差异，可能与肿瘤类型不同miR-132发挥作用的机制不同，本实验结果显示在哈萨克族食管癌组织中miR-132高表达与临床分期及淋巴转移相关，我们推测miR-132可能作为一个致癌性miRNA参与哈萨克族食管癌细胞的生长侵袭。

本实验中miR-130b在哈萨克族食管癌组织中表达也显著升高，提示miR-130b高表达参与了哈萨克族食管癌的发生发展过程，但在病理指标分析中miR-130b高表达与细胞分化、临床进展分期及淋巴转移均无显著差异。有实验表明在食管癌肿瘤组织和细胞中，高表达的miR-130b可以作为肿瘤启动子促进食管鳞状细胞癌肿瘤的生长，抑制miR-130b表达可显著降低食管癌细胞的增殖和侵袭性[12-13]。我们的实验结果证实在哈萨克族食管癌发生发展过程中miR-130b表达失调，显著上调，与以往的研究基本相符，但高表达的miR-130b与细胞分化、临床进展分期及淋巴转移不相关，分析其可能原因一是是样本量略小，不能够全面反映出miR-130b与病理指标的关系，另一原因可能是miR-130b的作用机制并不是直接调控肿瘤细胞的增殖凋亡及转移，而是作为一个调控分子，通过其他miRNA而发挥作用。

miR-141、miR-143、miR-133b等3个microRNA在47例哈萨克族食管癌组织中呈现出表达下调的趋势，与癌旁组织相比差异显著。在低分化的肿瘤组织中miR-141、miR-143、miR-133b的表达均显著降低，且miR-143、miR-133b低表达与淋巴转移相关，提示miR-141、miR-143、miR-133b表达失调参与了哈萨克族食管癌细胞分化增殖、侵袭转移过程，miR-141、miR-143、miR-133b低表达更有利于肿瘤细胞增殖及侵袭生长。有研究表明，miR-141在上皮间质转化的肿瘤进展和转移过程中发挥重要的抑癌作用[14-15]，上皮间质转化是上皮细胞恶性肿瘤细胞迁移、侵袭的重要生物学过程，而miR-141可以通过激活靶基因ZEB1和SIP1(转录因子)抑制上皮间质转化，在肿瘤组织中miR-141低表达则意味着对上皮间质转化抑制作用丧失。Ni等[17]研究发现miR-143在食管鳞癌组织中表达显著降低，并和肿瘤浸润及淋巴结转移呈负相关，体外细胞实验中上调miR-143的表达可以显著抑制食管癌细胞的生长及迁移和侵袭能力，miR-143在食管癌发生过程发挥抑癌基因的作用可能与细胞外信号调节激酶ERK-5有关。目前普遍认为miR-133是人类许多恶性肿瘤的抑癌因子，荧光素酶报告试验证实EGFR是miR-133b在食管鳞状细胞癌的靶点，提示其调控机制可能与表皮生长因子受体EGFR有关，过表达miR-133b通过直接下调EGFR显著降低PI3K、ERK和AKT的磷酸化从而抑制MAPK/ERK和PI3K/AKT信号通路激活，从而抑制食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭[18]。本实验中miR-141、miR-143、miR-133b在哈萨克族食管癌组织中表达下调，且与食管癌临床分期，淋巴结转移，组织分化相关，与以往研究结果基本相符，提示在哈萨克族食管癌组织中miR-141、miR-143、miR-133b表达失调，失去了对肿瘤细胞的正常抑制作用。

虽然miR-195在哈萨克食管癌组织中的表达显著低于癌旁组织，但其低表达在细胞分化、临床进展分期及淋巴转移分组中并没有显著差异，提示虽然miR-195在哈萨克食管癌发生发展中表达失调，但其发挥作用的机制并不清楚。有研究表明，在肝癌患者清中miR-195的表达下调，并与淋巴结转移和TNM分期有关，miR-195过表达可抑制细胞增殖、迁移和侵袭[19]。本实验结果与以往研究存在不同点，有待于扩大样本进一步证实。

有研究显示miR-140低表达与肿瘤分期或转移有关，直肠癌中miR-140的表达明显下降，过表达的miR-140可直接抑制直肠癌细胞的增殖和侵袭[20]。本实验中与远端正常组织相比，miR-140在哈萨克食管癌组织中的表达降低，但无统计学意义，47例肿瘤组织中的检测结果与芯片结果不一致，可能与标本例数不大有关，也有可能是芯片检测存在一定的误差，可扩大标本量进行深入探索。

综上所述，除miR-140，其他7个miRNA在食管癌中的表达结果与基因芯片检测结果一致，提示利用miRNA表达谱基因芯片可筛查出与食管癌发生有关的差异表达miRNAs。MiRNA与其靶基因以及一些相关的重要功能基因构成一个复杂的调控网络，miRNA表达失控可引起其调控的靶基因及相关信号通路激酶组成的调控网络发生异常，从而促成肿瘤的发生及演进，在食管癌的发生发展中发挥了重要作用。