阿尔茨海默病相关血液学标志物研究进展

陈小童，林 勇

（复旦大学附属华山医院检验医学科，上海 200040）

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一种中枢神经系统退行性疾病，主要临床表现为记忆、认知障碍以及后期的人格和行为改变等。据统计，AD在全球广泛流行，截至2013年，全球约有4400万人罹患痴呆，预计至2050年，患病人数将达到1.3亿，其中50%～75%为AD患者[1]。

随着研究的深入，学者们发现在AD早期即可出现细胞外淀粉样β蛋白（amyloid betaprotein，Aβ）异常沉积、细胞内神经原纤维缠结以及脑组织的核酸氧化、线粒体损伤等[2]。这提示AD是一个连续发展的疾病，通过对其病理生理特征的监测或许有利于更加早期、全面地治疗AD。2007年发布的国际工作组织（the International Working Group，IWG）-1诊断标准首次将生物标志物纳入AD诊断标准[3]。2014年发布的IWG-2诊断标准将AD相关生物标志物进行了分类[4]。美国国立衰老研究所和美国阿尔茨海默病协会将生物标志物作为临床前AD的诊断标准，并作为AD源性轻度认知障碍（mild cognitive impairment，MCI）以及AD源性痴呆的支持性证据[5]。由此可见，生物标志物在AD的进展中有重要的价值。

目前，主要通过磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）、正电子发射型计算机断层显像（positron emission computed tomography，PET/CT）[6]以及脑脊液（cerebrospinal fluid，CSF）相关项目[7]等针对“大脑”的AD生物标志物进行检测。此类方法存在价格高、创伤性大、技术要求高等缺点。事实上，AD的发生、发展并不局限于中枢神经系统，而是与全身各器官、组织、细胞代谢活动密切相关，是更加系统、复杂的过程。Aβ的异常沉积与AD的发生、发展息息相关，而Aβ的产生和清除过程由大脑和外周共同参与。有研究结果显示，大脑中近60%的Aβ可运输至外周被清除，而外周产生的Aβ也可进入大脑并参与AD的病理过程[8]。大脑与外周Aβ代谢的相互作用及动态变化提示或许可通过检测外周血相关指标监测AD的发生、发展。血液学标志物的检测相对简便、易行，可弥补现有检测方法的不足。为此，本文拟对AD相关血液学标志物的研究现状进行分类阐述。

1 预测型AD血液学标志物

预测型AD血液学标志物可在AD无症状期表达，对AD的发生风险有一定预测价值。

淀粉样蛋白的病理现象被认为是最早期的AD病理改变[5]，常预示着更高的患病风险。VERBERK等[9]建立Cox比例风险回归模型后发现，血浆Aβ42/Aβ40比值越低，预示着临床进展至MCI和AD阶段的风险越高[风险比（hazard ratio，HR）为2.03，校正年龄和性别后的HR为1.67]，血浆Aβ42/Aβ40比值与CSF Aβ42水平密切相关，若将血浆Aβ42/Aβ40比值用于MCI和AD的诊断，可以减少50%以上用于检测CSF Aβ42的腰椎穿刺。NAKAMURA等[10]采用免疫沉淀联合质谱对日本国家老年医学中心的121份血液样本及澳大利亚老龄化影像学、生物标志物和生活方式研究的252份血液样本进行淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）及Aβ检测，结果显示血浆APP669-711/Aβ1-42比值和Aβ1-40/Aβ1-42比值联合检测与PET/CT结果密切相关，以PET/CT结果作为反映脑Aβ沉积程度的标准，分别制作2项指标联合检测的受试者工作特征曲线，其曲线下面积均＞90%，准确性为90%，提示血浆APP669-711/Aβ1-42比值和Aβ1-40/Aβ1-42比值联合检测可在一定程度上反映脑Aβ的沉积情况。由此可见，与血浆Aβ42相关的联合检测结果可作为AD的预测指标，但尚无充分证据表明单独检测血浆游离Aβ42和Aβ40水平与AD的发生、发展过程有关。除血液Aβ水平有变化外，Aβ的二级结构也会随AD的发展而发生变化。NABERS等[11]采用免疫-红外线探测仪，通过Aβ抗体“捕获”Aβ，以酰胺Ⅰ带作为目标条带，经红外线照射后产生最大吸收峰，设1642 cm-1为阈值，β-折叠将使峰值移向＜1642 cm-1一侧。他们采用巢式病例对照研究方法，以2000—2002年收集的血液样本作为基线，测量其酰胺Ⅰ带吸收峰值，在长达8年的随访后，统计暴露的AD患者与非AD对照者的吸收峰值，发现AD患者的吸收峰值显著低于非AD对照者，该法的阳性似然比为7.9，提示该法可用于早期筛查AD高风险人群。

随着研究的深入，学者们发现在AD进程中，大脑的代谢活动会产生与之相关的变化。因此，近年来有许多研究利用代谢组学探索与AD相关的血液学生物标志物。VARMA等[12]同时检测了大脑与外周血的同一组代谢物，结果发现有4种鞘脂类代谢物在血液中的水平越高，未来AD的发病风险越大。

2 进展型AD血液学标志物

进展型AD血液学标志物在AD病程进展（包括MCI和AD阶段）中的表达有明显差异。

Aβ的生成与β-分泌酶（beta amyloid cleavage enzyme，BACE）相关。BACE 1介导了APP的第1次剪切，是Aβ生成的限速酶。有研究结果显示，与健康对照组比较，MCI组和AD组血浆BACE 1活性分别增加了53.2%和68.9%，且能反映MCI转变为“可能为AD”的可能性[13]。

氧化应激与AD的病理过程息息相关，氧化应激相关的氧化产物或能作为AD的生物标志物。异前列腺素（isoprostane，IsoP）是反映体内氧化应激和脂质过氧化反应的可靠的生物标志物之一。PEÑA-BAUTISTA等[14]对血浆中18种IsoP进行分析，结果显示AD组有6种IsoP明显高于正常对照组（P＜0.01）。载脂蛋白（apolipoprotein，apo）一直以来都被认为在AD病理过程中扮演着重要角色，如apo E基因与晚发型AD关系密切[7]，apo J可作为分子伴侣调控氧化损伤[15]。有研究结果显示，MCI组和AD组血浆apo J水平明显高于健康对照组（P＜0.001、P＜0.05），但与认知量表评分高低无关[16]。与氧化应激相关的血液抗氧化酶在AD进程中也发生了变化，如超氧化岐化酶、谷胱甘肽过氧化物酶[17]，且人体总抗氧化力呈下降趋势。PERROTTE等[16]的研究结果显示，血浆总抗氧化力与临床认知量表评分有关，提示总抗氧化力与认知衰退程度有一定关系。

另外，神经炎症在AD进程中也扮演着重要的角色。淀粉样蛋白瀑布假说（amyloid cascade hypothesis，ACH）认为Aβ的异常沉积可激活中枢神经系统中特有的免疫细胞，如小胶质细胞、星形胶质细胞等，继而释放多种炎性介质，参与神经炎性斑块的形成[18]。HENEKA等[19]的研究结果显示，炎症反应可能在神经炎性斑块形成之前就已发生，这一过程可促进Aβ沉积、tau蛋白聚集等AD病理过程。因此，检测相关炎症介质水平或许可在一定程度上反映AD的病情进展情况。FORLENZA等[20]的研究结果显示，AD组和MCI组血清白细胞介素（interleukin，IL）1β水平明显高于正常对照组（P=0.03）。

3 支持诊断型AD血液学标志物

支持诊断型AD血液学标志物在AD患者与非AD者或正常对照者之间表达有明显差异。

Aβ相关指标在AD预测及进展监测中发挥了重要作用，而Aβ相关基因，如APP、早老素（presenilin，PS）基因突变在AD诊断，尤其是在家族性AD的诊断上已被广泛认同。淀粉样蛋白瀑布假说认为AD的产生在于Aβ过量生成及清除减少[21]，而Aβ是由APP经BACE和γ-分泌酶水解后产生的，因此APP基因突变成为淀粉样蛋白瀑布假说成立的有力证据之一，如APP基因的β分泌酶剪切位点突变（APPKM670/671NL突变）可促进Aβ产生，E693G位点突变使Aβ从寡聚体向原纤维转变，有利于Aβ沉积、E682K位点突变，加快AD进程等。然而，并非所有的APP基因突变都会致病，如APP基因A673T突变可减少Aβ的生成[21]。PS蛋白是组成γ-分泌酶催化亚基的蛋白复合物，可介导APP的膜内切割，产生Aβ。PS基因突变常表现为PS蛋白功能缺失，使γ-分泌酶失去活性，Aβ生成减少[22]。然而，这并不能将其定性为有益突变。有研究结果显示，PS基因突变产生的效应与淀粉样蛋白瀑布假说相一致[23]。

Tau蛋白是微管相关蛋白。在生理状态下，tau蛋白不折叠且几乎无聚集倾向。正常成人每个tau蛋白分子中约有2个位点磷酸化，而AD患者每个tau蛋白分子中平均有8个位点磷酸化[24]，tau蛋白的过度磷酸化可改变tau与其他蛋白的正常相互作用，使其脱离微管，促进tau蛋白的聚集，导致突触功能异常。MIELKE等[25]的研究结果显示，AD组血浆总tau蛋白和磷酸化tau181蛋白水平均明显高于认知正常组（P＜0.01）。有Meta分析结果显示，AD组CSF总tau蛋白及磷酸化tau蛋白水平分别是正常对照组的2.54倍和1.88倍，且磷酸化tau蛋白诊断AD的特异性高于总tau蛋白[26]。

CORSI等[27]对外周血中炎性介质、内皮细胞功能与AD及认知衰退的关系进行了研究，结果显示，AD组血浆IL-8（P=0.01）、γ干扰素（interferon gamma，IFN-γ）（P=0.026）、人单核细胞趋化蛋白-1（P=0.05）及血管内皮生长因子（P=0.049）水平均高于正常对照组，P-选择素（P＜0.0001）和L-选择素（P=0.0002）均低于正常对照组，且认知损伤最严重的AD患者P-选择素和L-选择素水平最低。在植物血凝素的刺激下，外周血单个核细胞分泌的IFN-γ等细胞因子水平和血清细胞因子水平异常也可能与AD发病相关[28]。此外，AD患者血清中的其他炎症因子，如IL-10、IL-1β和IL-17等也明显高于正常对照组[29]。分化簇（cluster of differentiation，CD）40是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白，目前应用较多的是将其作为与淋巴细胞功能相关的表面抗原。有研究结果显示，在AD患者的大脑皮质、神经炎性斑块及反应性小胶质细胞聚集中，CD40的反应原性明显增强[30]。MOCALI等[31]的研究结果显示，晚发型AD患者血浆可溶性CD40明显高于正常对照组（P＜0.001），且该水平的差异与apo E表达无关。该研究结果在一定程度上为晚发型AD的诊断提供了新的依据。然而，目前尚未在AD患者或MCI患者CSF中发现可溶性CD40[32]，其内在机制有待进一步研究。

AD患者免疫和炎症系统的系统性改变部分是由于其外周血CD3+淋巴细胞水平降低所致。TRAMUTOLA等[33]利用蛋白质组学方法研究了AD患者和非痴呆患者血液中3-硝基酪氨酸的蛋白质组，鉴定了10种蛋白质，结果显示AD患者CD3+T细胞中3-硝基酪氨酸水平显著高于非痴呆患者（P＜0.05）。还有研究结果显示，与正常对照者比较，AD患者外周血单个核细胞内微小RNA（microRNA，miRNA）-34a升高（P＜0.05），miRNA-34c在AD患者单个核细胞内（P＜0.05）及血浆中（P＜0.01）均明显升高[34]。

此外，氧化应激相关指标、外泌体及细胞外miRNA也与AD相关。丙二醛是常用的膜脂过氧化指标。有研究结果显示，AD患者血浆丙二醛水平变化显著[35]。FIANDACA等[36]的研究结果显示，AD组血浆中源自神经元外泌体的P-S396-tau、P-T181-tau和Aβ1-42水平显著高于认知正常组（P＜0.0001）。HARA等[37]的研究结果显示，AD组血清has-miRNA-501-3p下调，但脑中has-miRNA-501-3p水平上调，相应的细胞实验结果显示，过表达has-miRNA-501-3p的细胞可下调128种基因位点的表达，而这些基因与DNA复制和细胞周期相关，提示血清hasmiRNA-501-3p可能与AD患者大脑中细胞损伤和凋亡相关。另外，AD患者血清外泌体miRNA-135a、miRNA-384表达显著升高，miRNA-193b表达明显下调[38]。由此可见，miRNA有望被用于诊断AD。

4 结论

AD在全球范围内已引起广泛关注，越来越多的研究结果表明在AD进程中，中枢与外周的联系密切，如小胶质细胞作为中枢神经系统最重要的免疫细胞之一，参与Aβ的清除及突触功能的发挥[39]，免疫相关的基因及通路的表达在AD患者大脑及外周中均有变化[40]。有研究结果显示，外周的炎症刺激可诱导大脑急性的“免疫训练”及“免疫耐受”，在AD小鼠模型中，免疫训练可加剧大脑Aβ沉积，而免疫耐受则可减轻Aβ沉积，表明外周的刺激可影响大脑的免疫记忆，继而影响AD的病理过程[41]。介导外周炎症和大脑之间沟通的“桥梁”包括血脑屏障的损伤、细胞因子和炎症介质的信号传递、脑内皮细胞、小胶质细胞等。这种密切联系为AD相关血液学生物标志物的研究打下了基础，为其在临床上的应用提供了可能。

目前，用于衡量AD血液学标志物的依据主要包括：（1）是否与PET/CT或CSF中相关标志物的变化相关，借此反映大脑Aβ的沉积情况或tau蛋白的磷酸化情况；（2）是否在AD无症状期、MCI和AD期进程中变化显著，以提示生物标志物与AD有一定的相关性。但以上依据尚有一定的局限性：首先，目前PET/CT或CSF指标的变化能否较准确地反映AD进展还有待商榷，如临床分期与大脑中Aβ的沉积情况并不完全相符；其次，目前常见的晚发型AD与年龄密切相关，而许多疾病也与年龄相关，因此需充分考虑年龄因素并排除其他疾病因素干扰；再次，目前主要运用的检测方法为免疫分析法和分子生物学检测方法，检测结果重复性较差，假阳性率、假阴性率较高，原因可能为分析前样本采集、运送、提取等方式不同[42]，分析方法不一致[43]，血脑屏障损伤与AD相关[44]但无法量化，受AD有关危险因素及其他疾病的影响[45]，血液本身的复杂性导致分析结果出现差异[46-47]。除了规范的实验操作及选择适当的检测方法可在一定程度上减少额外的变异外，所选的生物标志物种类、数量及分析方法也可影响研究结果，因此目前出现了许多组学研究，如蛋白质组学[48]、基因组学[49]、脂质组学[50]等，试图更加全面地反映AD诱导的相关生物标志物的变化。

总之，AD是全世界面临的共同难题，因而在科研上也需要无国界的通力合作，克服难题，共同寻找理想的生物标志物。理想的血液学标志物将以其独特的优势在AD的筛查和诊断中得到推广和应用。