恩替卡韦分散片微生物限度检查方法适用性研究*

吴伟平，陈宇，黄丽华，梁蔚阳

（广东省药品检验所生物制品室·国家药品监督管理局血液制品质量控制重点实验室·广东省药品监督管理局血液制品质量控制研究重点实验室，广东 广州 510663）

1 试药、菌种与仪器

样品：恩替卡韦分散片，样品1（山东鲁抗医药股份有限公司，批号为170101，规格为每片0．5 mg）；样品2（苏州东瑞制药有限公司，批号为160517105，规格为每片0．5 mg）；样品3（安徽贝克生物制药有限公司，批号为167070058，规格为每片0．5 mg）；样品4（海南中和药业股份有限公司，批号为20170101，规格为每片0．5 mg）；样品5（正大天晴药业集团股份有限公司，批号为170209101，规格为每片0．5 mg）；样品6（江西青峰药业有限公司，批号为20170111，规格为每片0．5 mg）。

菌种：大肠埃希菌［CMCC（B）44102］，金黄色葡萄球 菌［CMCC（B）26003］，铜 绿 假 单 胞 菌［CMCC（B）10104］，枯草芽孢杆菌［CMCC（B）26003］，白色念珠菌［CMCC（F）98001］，黑曲霉［CMCC（F）98003］，均由中国食品药品检定研究院提供，均为第3代。

培养基：胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）、胰酪大豆胨液体培养基（TSB）、沙氏葡萄糖液体培养基（SDB）、麦康凯液体培养基、麦康凯琼脂培养基（MAC），均由中国食品药品检定研究院提供，按使用说明书配制，培养基适用性符合规定。

仪器：CL-40M型高压灭菌器（日本ALP株式会社）；GRX-12A型干热消毒箱（上海森信实验仪器有限公司）；LRH-250A型生化培养箱（广东省医疗器械厂）；MIR-254-PC型恒温培养箱（松下健康医疗器械株式会社）；BS323S型电子天平（赛多利斯公司，万分之一）。

2 方法与结果

2．1 计数方法适用性试验

2．1．1 菌液制备

分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至TSB中，经32℃培养24 h后，培养物用无菌0．9%氯化钠溶液10倍稀释至每1 mL含菌数为不大于1×104cfu的菌悬液，备用。接种白色念珠菌的新鲜培养物至SDB中，经23℃培养48 h后，培养物用无菌0．9%氯化钠溶液制成每1 mL含菌数为不大于1×104cfu的菌悬液，备用。接种黑曲霉的新鲜培养物至SDA斜面培养基中，经23℃培养7 d后，加入5 mL含0．05%聚山梨酯80的无菌0．9%氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸出孢子悬液置无菌试管内，用含0．05%聚山梨酯80的无菌0．9%氯化钠溶液制成每1 mL含孢子数不大于1×104cfu的孢子悬液。备用。

2．1．2 供试液制备

负向迁移即母语干扰,主要是由于母语和目的语的某些形式和规则系统不同而被(学习者)误以为相同所致，从而对学习产生不利影响。有学者对母语在二语习得中的负迁移影响进行了详细地概括。

称取样品10 g，加pH 7．0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL，混匀，作为1∶10的供试液。取上述供试液50 mL，加pH 7．0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL，作为1∶20的供试液。

2．1．3 回收比值测定

采用平皿法（倾注法）测定。

试验组：取含菌量不大于1×104cfu／mL的菌悬液0．1 mL分别加至10．0 mL（1∶10，1∶20）供试液中，混匀。取上述供试液1．0 mL，置直径为90 mm的平皿中，注入20 mL温度不超过45℃熔化的培养基（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌组倾注TSA，白色念珠菌、黑曲霉组倾注TSA和SDA 2种培养基），每株试验菌每种培养基分别平行制备2组平皿，混匀，凝固。TSA倒置于32℃培养箱培养3 d，SDA倒置于23℃培养箱培养5 d，观察培养结果，并计数。

供试品对照组：取供试液，以pH7．0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替菌液，同试验组方法操作。

菌液对照组：取pH 7．0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液替代供试液，按试验组方法操作加入试验菌液，并进行微生物回收试验。

计算方法：回收比值＝（试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数）／菌液对照组平均菌落数。

2．1．4 方法适用性试验结果

6个样品的平皿法（1∶10供试液，1∶20供试液）微生物限度检查计数方法适用性试验结果见表1。可见，供试品对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌均有微弱的抑制作用，回收比值范围为0．5～2．0；对黑曲霉未表现出抑菌作用，回收比值均大于0．86。随着供试品浓度的稀释，供试品对5种代表菌株的抑制作用均有不同程度的减弱，回收比值增大，数值稳定。根据计数方法适用性试验结果，确定恩替卡韦分散片微生物限度检查法为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数均采用1∶20的供试品进行平皿法（倾注法）检查。

2．2 控制菌检查方法适用性试验

2．2．1 检测依据

恩替卡韦分散片为口服给药制剂，按2015年版《中国药典（四部）》微生物限度要求，应对大肠埃希菌作控制菌检查。

2．2．2 溶液制备

称取样品10 g，加pH 7．0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至200 mL，混匀，作为1∶20的供试液。接种大肠埃希菌的新鲜培养物至TSB中，经32℃培养24 h后，培养物用无菌0．9%氯化钠溶液10倍稀释至每1 mL含菌数不大于1×102cfu的菌悬液，备用。

表1 恩替卡韦分散片微生物检查回收比值（1∶10供试液／1∶20供试液）

2．2．3 方法适用性试验与结果

试验组：取上述1∶20供试液20 mL及含菌量为不大于1×102cfu／mL大肠埃希菌的菌悬液1 mL加至200 mL TSB中，32℃培养24 h后，取培养物1 mL接种至100 mL麦康凯液体培养基中，43℃培养48 h。取麦康凯液体培养物划线接种于MAC平板上，32℃培养72 h。

供试品对照组：取制备好的供试液，以pH＝7．0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替菌液，同试验组方法操作。

菌液对照组：取pH 7．0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液替代供试液，同试验组方法操作。

结果见表2。可见，6个样品控制菌试验组与菌液对照组结果均为阳性（＋），检出大肠埃希菌，供试品对照组均未检出，表明恩替卡韦分散片可按2015年版《中国药典（四部）》控制菌（大肠埃希菌）检查法行大肠埃希菌检查，经方法适用性试验成立。

表2 恩替卡韦分散片控制菌检查方法适用性试验结果

3 讨论

微生物限度检查计数方法适用性试验与控制菌检查方法适用性试验是确认供试品在所采用检查方法和检验条件下，药物抑菌作用尽可能被降低甚至达到无抑菌作用，以保证供试品中被污染的微生物能被检出。具有抑菌成分的药物进行微生物限度检查时，要求供试品本身在试验条件下有效排除其抑菌作用，使其不干扰染菌的限度检验，结果方属有效［9］。当有几种计数方法回收比值同时达到0．5～2．0时，应综合考察结果的稳定性，操作的易行性及观察的直观性，采用风险系数最小的检查方法。

本试验中收集了市面上6个药品生产企业生产的恩替卡韦分散片，覆盖面广，有一定代表性。在试验中发现，制备1∶10的恩替卡韦分散片溶液呈乳白色混悬液，存在不溶性白色颗粒物，对菌落的回收试验产生干扰。选取的6个企业生产的恩替卡韦分散片含量及溶出度均符合规定，但对细菌和酵母菌抑制力的不同，提示分散片不同的处方工艺对菌落可产生不同的抑制作用。将供试液进一步稀释成1∶20时，不溶性颗粒物对菌落回收的干扰大幅减少，6个企业生产的恩替卡韦分散片对细菌和酵母菌的抑制作用均大幅减少，回收比值趋于稳定，提示可通过提高供试液的稀释级来降低药品的抑菌作用。本试验中建立的恩替卡韦分散片微生物限度检查方法，采用平皿法（倾注法）能真实、准确、有效地反映药品中污染存活的微生物。