子午流注针法对心理应激大鼠HPA轴中枢调控的影响

王毅,王雯,ANGGARAENI KOMANG ROSA TRI,王儒蒙,张艾嘉,董烨卿,吴吉霞,许英萍,胡智海

·动物实验·

子午流注针法对心理应激大鼠HPA轴中枢调控的影响

王毅1,王雯1,ANGGARAENI KOMANG ROSA TRI2,王儒蒙1,张艾嘉1,董烨卿1,吴吉霞3,许英萍3,胡智海1

(1.上海市中西医结合医院,上海 200082;2.上海中医药大学,上海 201210;3.上海市虹口区欧阳路街道卫生服务中心,上海 200081)

观察子午流注针法对心理应激大鼠HPA轴中枢调控中促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、血清皮质醇(CORT)及免疫因子白细胞介素1(IL-1)的影响,探讨子午流注针法治疗心理应激的机制。52只Wistar大鼠随机分为子午流注开穴组、针刺对照组、造模组、正常组,每组13只。采用旁观电击实验建立心理应激模型。子午流注开穴组以养子时刻开穴法定时开穴治疗,针刺对照组针刺取百会穴。放射免疫法分别检测血清CORT和ACTH含量、下丘脑中CRH含量、垂体中ACTH含量、肾上腺中CORT含量,免疫组化法、RT-PCR法分别检测下丘脑、垂体中IL-1及其mRNA表达水平。与正常组比较,造模组大鼠血清CORT和ACTH水平、下丘脑中CRH含量、垂体中ACTH含量、肾上腺中CORT含量显著升高(＜0.01),下丘脑、垂体中IL-1及其mRNA表达水平显著升高(＜0.01);与造模组比较,子午流注开穴组大鼠血清CORT和ACTH水平、下丘脑中CRH含量、垂体中ACTH含量、肾上腺中CORT含量显著降低(＜0.01),下丘脑、垂体中IL-1及其mRNA表达水平显著降低(＜0.01);与针刺对照组比较,子午流注开穴组大鼠血清CORT和ACTH水平、下丘脑中CRH含量、垂体中ACTH含量、肾上腺中CORT含量明显降低(＜0.05),下丘脑、垂体中IL-1及其mRNA表达水平明显降低(＜0.05)。子午流注开穴针法可以调控心理应激大鼠CRH、ACTH、CORT的异常分泌,促进处于异常状态的HPA轴向正常状态恢复,其作用机制可能与下调IL-1 mRNA,减少诱发ACTH的分泌,传递信号参与大脑中枢调控有关,从而改善机体出现应激状态。

子午流注针法;心理应激;HPA轴;中枢调控;白细胞介素1;大鼠

随着社会环境和生活方式的改变,人们更易产生抑郁、焦虑、紧张等应激心理,导致抑郁症、焦虑症、睡眠障碍等疾病发生,对社会和家庭都造成严重的不良影响。因此近年来心理应激因素参与疾病的发生、发展的临床及机制研究得到广泛重视。

研究表明,心理应激触发机体产生的生理学效应包括急性自主神经功能不全、神经内分泌激活、血流动力学改变和引发炎症反应过程[1-2]。研究发现,下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴在心理应激的发生、发展和康复过程中扮演重要角色,应激反应的中枢效应主要发生在HPA轴,而促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、血清皮质醇(CORT)及免疫因子白细胞介素1(IL-1)被认为在HPA轴中枢调控中发挥重要的作用[3]。目前心理应激以心理治疗为主,再辅以对症的药物,但是心理治疗费用昂贵,疗效也不稳定,药物不良反应多[4]。针灸治疗心理应激具有效率高、安全性好及疗效稳定的特点,临床中已得到验证[5-8]。尤其是子午流注针法在临床治疗应激相关疾病如抑郁症、焦虑症、睡眠障碍都有较好疗效[9-14]。其治疗机制与调控HPA轴功能,减少相关激素(如CRH、ACTH、CORT)的分泌有关。本实验建立心理应激大鼠模型,采用子午流注针法为治疗方法,观察其行为表现、旷场试验评分,CRH、ACTH、CORT含量,IL-1及其mRNA表达的影响,探讨子午流注针法在治疗心理应激中的作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康成年雄性SPF级Wistar大鼠69只,体质量162.6～203.1 g,上海中医药大学实验动物中心提供,许可证号[SYXK(沪)2014-0008]。所有大鼠同一室内饲养(温度23～25℃,相对湿度40%～50%,环境安静,自由摄食、饮水)。

1.2 主要仪器与设备

自制交流箱,电动匀浆机(PRO200,上海FLUKO公司),移液枪(P2、P10、P20、P100、P200、P1000,吉尔森P型移液器公司),旋涡振荡器(K30,青浦泸西仪器厂),低温冷冻离心机(TG-16M,上海卢湘仪离心机仪器有限公司),Real-time检测仪(ABI-7300,美国ABI公司),恒温烘箱(DHG-9023A,上海恒一科学仪器有限公司),石蜡切片机(SQ2125,徕克公司),正置显微镜(CX41,OLYMPUS公司)。

1.3 主要试剂

水合氯醛(上海国药集团化学试剂有限公司),IHC免疫组化试剂盒(JRDUN公司,中国),IL-1b兔多克隆抗体(Abcam公司,英国),二抗(Abcam公司,英国,羊抗兔),Trizol Reagent(Invitrogen公司,美国),逆转录试剂盒(aKaRa公司,日本),SYBGreen PCR试剂盒(Thermo公司,美国),Rat CRH ELISA Kit(JRDUN公司,中国),COAT放免测定试剂盒(北京北方生物技术研究所,中国),ACTH放免测定试剂盒(中国北京北方生物技术研究所),30%H2O2(上海国药集团),DAB浓缩型试剂盒(上海长岛生物技术有限公司),苏木素(BASO)。

1.4 分组与模型制备

全部大鼠中的17只作为应激源大鼠,其余52只采用二次随机法先分为两组,13只设为正常组,另外39只进行造模,造模成功后再随机分为子午流注开穴组、针刺对照组、造模组,每组13只。

参照贾克然提供的方法[15]对大鼠进行造模,在交流箱(42 cm×42 cm×22 cm)中进行,该箱参照Ogawa和Kuwabara设计的交流箱[16]基础上改进。具体方法为在交流箱下层放入应激源大鼠,上层放入造模大鼠,下层底部的铜丝组成连接电源,给应激源大鼠足部间断电击,使其感受痛苦;上层造模大鼠透过透明有孔玻璃板感受应激源大鼠发出的声音、气味等刺激。造模大鼠每天上午9:00—12:00进行应激造模,每次30 min,持续2周。其间观察造模大鼠行为表现、旷场试验评分,用以评判造模成功与否,行为表现不明显,水平得分、垂直得分未显著下降者剔除实验。行为评定采用盲法,三位观察者观察录像评分,一致性大于0.95。

应激源大鼠仅用于产生刺激,不进行其他实验处理。正常组大鼠在相同的时间段放入交流箱各小室相同时间,但不进行应激。

1.5 干预方法

取阳辅、阳谷、解溪、阳溪、昆仑、支沟、百会。参照《实验针灸学》“常用的大鼠针灸穴位及图谱”[17],并结合解剖学方法及拟人对照法进行大鼠穴位定位。阳辅,小腿下1/4折点处腓骨头与外踝连线上;阳谷,桡腕关节背外侧,尺骨远端与尺腕骨之间凹陷中;解溪,踝关节背侧中部两筋之间;阳溪,腕横纹之桡侧凹陷处;昆仑,踝关节外侧后方,外踝高点与跟结节之间凹陷中;支沟,前肢外侧距腕关节4 mm,尺、桡骨间;百会,顶骨正中。

子午流注开穴组:将大鼠仰卧位束缚于大鼠固定架上,以养子时刻开穴法定穴,按日时干支推算出甲日戊辰时开阳辅穴,乙日庚辰时开阳谷穴,丙日壬辰时开解溪穴,丁日甲辰时开阳溪穴,戊日丙辰时开昆仑穴,己日戊辰时开支沟穴,庚日庚辰时开阳谷穴,辛日壬辰时开解溪穴,壬时甲辰时开阳溪穴,癸日丙辰时开昆仑穴,消毒后直刺大鼠双侧穴位,选用0.18 mm×13 mm一次性针灸针,针刺深度3～5 mm,捻转行针后留针20 min。每日1次,连续治疗21 d。

针刺对照组:与子午流注开穴组同时开始治疗,取百会,平刺进针,针刺深度5 mm,捻转行针后留针20 min。每日1次,连续治疗21 d。

造模组和正常组束缚20 min不针刺。每日1次,连续干预21 d。

1.6 观察指标

1.6.1 行为学测试

旷场测试(open field test, OFT),测试敞箱(80 cm×80 cm×40 cm),将底面平分为30个方格。实验前60 min将待测大鼠放入测试间以适应环境。实验时将大鼠放置在敞箱正中央,观察并记录3 min内大鼠的水平运动格数和垂直竖立次数,计算水平和垂直得分数总和,并分组记录。

1.6.2 下丘脑中CRH含量测定

治疗结束后第二天腹腔注射水合氯醛(0.03 mL/kg)麻醉大鼠,腹主动脉取血10 mL,断头后置于冰盘快速剥离下丘脑、垂体以及肾上腺,迅速置于液氮冷冻,稍后移至﹣80℃超低温冰箱冷冻保存备用。准确称量大鼠下丘脑组织,按质量体积1:9加入生理盐水研磨匀浆,3000 r/min离心后取上清液,严格按照CRH的ELISA试剂盒说明测定下丘脑组织中CRH的含量。在450 nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。

1.6.3 放射免疫法测定血清ACTH和CORT、垂体ACTH、肾上腺COAT含量

取血样2 mL,注入含10%EDTA二钠30mL的试管中,混匀4℃,3000 r/min离心10 min,分离血浆。分别取垂体、肾上腺入匀浆管,按质量体积1:9加入生理盐水匀浆,3000 r/min离心10 min,弃上清,﹣20℃保存。分别按ACTH、CORT放免测定试剂盒说明书测定各血清和组织中ACTH、CORT的含量。

1.6.4 免疫组化方法检测下丘脑、垂体中IL-1含量

取﹣80℃保存的大鼠下丘脑、垂体组织置于4%多聚甲醛固定24 h,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,切片。烤片后脱蜡至水化,微波修复抗原。3%双氧水消除内源性过氧化,湿盒孵育,滴加一抗,4℃孵育过夜。二抗孵育,DAB染色,苏木素复染,二甲苯中透明,中性树胶封片。通过显微镜拍照,采集分析样本相关部位,计算阳性面积。

1.6.5 RT-PCR方法检测下丘脑、垂体组织中IL-1 mRNA表达

IL-1上游引物5'-ATCTCACAGCAGCATCTC-3',下游引物5'-TAGCAGGTCGTCATCATC-3'(189 bps);Gapdh内参上游引物5'-GTCGGTGTGAACGGATTTG-3',下游引物5'-TCCCATTCTCAGCCTTGAC-3'(181 bps)。取下丘脑或垂体组织(约100 mg),按照Trizol说明书提取总RNA,在紫外分光光度仪上测定A260/A280比值,按逆转录试剂盒说明书要求,逆转录成cDNA,然后进行定量PCR 扩增。反应结束后核对扩增动力学曲线,以GAPDH为内参,通过2﹣△△ct法计算下丘脑、垂体IL-1 mRNA的相对表达量。

1.7 统计学方法

所有数据均使用SPSS21.0统计软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示,组间比较采用单因素方差分析,方差齐时选择法;不满足正态分布计量资料选择秩和检验。以＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠行为表现、旷场实验得分

造模组大鼠初次放入交流箱内,探索欲强,前爪直立,鼻嗅四壁。造模后期,受电击大鼠惊跳、尖叫的影响,造模组大鼠身体蜷缩,微闭双眼,处于惊恐状态。造模后,造模组大鼠和应激源大鼠排便便次、便量、气味和形状较正常组有明显变化,较造模前和电击前也有明显变化,便次增多、便量增多、气味臭秽、大便不成型。治疗期间,子午流注开穴组大鼠和针刺对照组大鼠的便次、便量、气味、形状均显著改善。造模后,造模组、针刺对照组和子午流注开穴组大鼠的旷场实验行为测定结果显示,水平得分和垂直得分低于正常组(＜0.01)。详见表1。

表1 大鼠旷场实验行为测定结果 (±s,分)

注:与正常组比较1)＜0.01

2.2 各组大鼠下丘脑中CRH含量的比较

与正常组比较,造模组大鼠下丘脑中CRH含量显著升高(＜0.01);与造模组比较,子午流注开穴组大鼠下丘脑中CRH含量显著降低(＜0.01),针刺对照组大鼠下丘脑中CRH含量有所下降(＜0.05);与针刺对照组比较,子午流注开穴组大鼠下丘脑中CRH含量降低(＜0.05)。结果提示,在应激心理模型造模成功后,下丘脑中CRH含量明显升高,而针刺可降低CRH,以子午流注开穴更为明显。详见图1。

注:与正常组比较1)P＜0.01;与造模组比较2)P＜0.05,3)P＜0.01;与针刺对照组比较4)P＜0.05

2.3 各组大鼠血清、垂体中ACTH含量的比较

与正常组比较,造模组大鼠血清和垂体中ACTH含量显著升高(＜0.01);与造模组比较,子午流注开穴组大鼠血清和垂体中ACTH含量显著降低(＜0.01),针刺对照组大鼠血清和垂体中ACTH含量有所下降(＜0.05);与针刺对照组比较,子午流注开穴组大鼠血清和垂体中ACTH含量降低(＜0.05)。结果提示,在应急心理模型造模成功后,血清与垂体中ACTH含量明显升高,而针刺可降低ACTH,以子午流注开穴更为明显。详见图2。

2.4 各组大鼠血清和肾上腺中CORT含量的比较

与正常组比较,造模组大鼠血清和肾上腺中CORT含量显著升高(＜0.01);与造模组比较,子午流注开穴组大鼠血清和肾上腺中CORT含量显著降低(＜0.01),针刺对照组大鼠血清和肾上腺中CORT含量有所下降(＜0.05);与针刺对照组比较,子午流注开穴组大鼠血清和肾上腺中CORT含量降低(＜0.05)。结果提示,在应急心理模型造模成功后,血清与肾上腺中CORT含量明显升高,而针刺可降低CORT,以子午流注开穴更为明显。详见图3。

2.5 各组大鼠下丘脑、垂体中IL-1表达的比较

本实验采用光学显微镜观察大鼠下丘脑和垂体的神经细胞,阳性颗粒主要分布于细胞膜表面,形成一薄层棕黄色颗粒包绕整个细胞。每张切片在中倍镜下(10×20)选取5个不同的视野,用显微图像分析系统(Image Pro Plus 5.1)检测,分析每张切片阳性细胞的阳性面积表达。

在正常组大鼠下丘脑和垂体出现IL-1抗体免疫阳性细胞,但阳性面积偏少。造模组大鼠下丘脑和垂体IL-1抗体免疫阳性细胞大量表达,分布广泛。子午流注开穴组与针刺对照组分别对照造模组,散在分布,颜色变浅,表达较低。

由表2可见,造模组阳性细胞表达增高,与正常组比较,差异具有统计学意义(＜0.01),说明造模后IL-1在下丘脑和垂体表达升高。子午流注开穴组与针刺对照组较造模组IL-1表达降低,差异具有统计学意义(＜0.01)。在下丘脑IL-1表达上子午流注开穴组与针刺对照组比较,差异有统计学意义(＜0.05);在垂体IL-1表达上子午流注开穴组与针刺对照组比较,差异具有统计学意义(＜0.01)。说明子午流注开穴、针刺穴位均能降低心理应激大鼠下丘脑和垂体中IL-1抗体免疫阳性细胞的表达,其改善心理应激状态可能与其促进HPA轴功能的调节有关,子午流注开穴的效果一定程度上更为明显。详见表2,图4-5。

表2 各组大鼠下丘脑中IL-1积分光密度、垂体中IL-1阳性面积表达比较 (±s)

注:与正常组比较1)＜0.01;与造模组比较2)＜0.01;与针刺对照组比较3)＜0.05,4)＜0.01

2.6 各组大鼠下丘脑、垂体组织中IL-1 mRNA表达的比较

与正常组比较,造模组大鼠下丘脑和垂体组织中IL-1 mRNA表达显著升高(＜0.01);与造模组比较,子午流注开穴组大鼠下丘脑和垂体组织中IL-1 mRNA表达显著降低(＜0.01),针刺对照组大鼠下丘脑和垂体组织中IL-1 mRNA表达有所下降(＜0.05);与针刺对照组比较,子午流注开穴组大鼠下丘脑和垂体组织中IL-1 mRNA表达降低(＜0.05)。见表3,图6。

表3 各组大鼠下丘脑和垂体组织中IL-1 mRNA表达比较 (±s)

注:与正常组比较1)＜0.01;与造模组比较2)＜0.05,3)＜0.01;与针刺对照组比较4)＜0.05

3 讨论

心理应激属于中医学“郁证”范畴,主要见于西医学的抑郁症、癔症、焦虑症及睡眠障碍等。中医学认为其基本病机为气机郁滞而致肝气郁结、心失所养、脏腑阴阳气血失调。《素问·灵兰秘典论》:“心者,君主之官也,神明出焉。”《灵枢·邪客》:“心者,五脏六腑之大主也,精神之所舍也。”张锡纯认为“心脑共主神明”,脑为髓海主元神,心为血脉主藏神,脑髓需心血不断充养,心神感知的神明活动需脑中元神统御,二者不可或缺[18]。其病位在心、脑,常累及诸脏。针灸有调心神、脑神、理气解郁的作用。子午流注开穴针法以时间变化为依据,根据气血流注盛衰开阖的理论,运用阴阳、五行变化,天干地支所司,脏腑、经脉所主,逐日按时开穴针刺;具有把握时间,按时取穴,协调人体与自然节律,维持气血阴阳平衡,有通经愈病的功效[19-20]。临床上子午流注针法在治疗应激相关疾病如抑郁症、焦虑症、睡眠障碍都有较好疗效[9-14]。现代时间生物医学研究表明,十二经脉流注经穴电位值均高于表里经穴电位值,并呈现同步变化,相邻的井、荥、输、经、合,各组五输穴电位值有明显的递增趋势,说明子午流注穴位开合确有其特异性及一定的物质基础[21]。研究表明子午流注针法采用五输穴调节经气、理气开郁,可有效治疗“郁证”,改善心理应激状态[22]。本实验发现针灸治疗慢性心理应激有其优势,子午流注开穴组治疗后的各项检测指标优于针刺对照组,说明治疗慢性心理应激,在辨证施治的基础上,结合日、时节律的影响,可以得到更好的疗效。

HPA轴是神经-内分泌-免疫的枢纽,应激反应的中枢效应主要发生在HPA轴,在心理应激中起到重要作用[23]。心理应激发生后,作用于大脑,改变脑的内分泌功能,其中最重要的途径是HPA轴被激活。下丘脑的室旁核(PVN)是HPA轴活动的直接控制部位,当应激信号沿中枢神经达到PVN时,引起促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)分泌。CRH促使垂体前叶释放促肾上腺皮质激素(ACTH),ACTH激活了肾上腺皮质细胞合成释放以皮质醇(CORT)为中心糖皮质激素(GC),促使机体各组织发生应激防御反应造成机体免疫力下降[24]。肾上腺皮质激素与情绪的关系至为密切,其中尤以糖皮质激素中的皮质醇、可的松的作用更为显著[25-26]。机体长期受到应激刺激则使HPA轴处于亢进状态,CRH、ACTH、CORT这3种激素分泌增加[27],则可能是心理应激发生的重要病理基础。

细胞因子IL-1主要参与介导炎症反应、调节免疫及机体代谢。IL-1由单核巨噬细胞等合成与分泌,应激过程中IL-1可通过血液循环与血管内皮细胞上的IL-1受体发生作用,激活第二级分子如NO等,再由它们调节下丘脑激素的合成和释放,最终引发较强的应激反应[28]。IL-1在正常大脑中以低水平表达,作为神经功能和神经元存活的调节剂[29],当应激或炎症刺激诱发时,IL-1释放量可显著增加,导致持续炎症引起免疫反应。大量证据表明IL-1和其他细胞因子能传递信号到大脑,其对HPA轴的调节是多水平、多方位的[30]。在中枢神经系统(CNS)对外周变化的免疫反应中,细胞因子是联系神经-内分泌-免疫系统网络的关键物质,研究表明IL-1bmRNA是诱导慢性应激向抑郁样行为发展的关键介导因子[31]。HPA轴释放的激素除糖皮质激素外,CRH和ACTH也参与免疫调节,应激引起免疫系统功能变化,致使淋巴细胞被激活,释放各种细胞因子,而后者又可反向作用于CNS,影响CNS的免疫调节作用,它们之间的作用是双向的[32-33]。因此,细胞因子IL-1能激活HPA轴,诱导下丘脑合成和释放CRH,诱导垂体合成和释放ACTH,诱导肾上腺合成和释放COAT,而血清CORT的增多反过来又可抑制IL-1的合成和分泌,可见IL-1扮演着重要的角色。

同时最新研究发现,内源性ACTH水平,在昼夜节律中有所不同,早上达到顶峰,并在一天中下降,而由垂体前叶分泌的ACTH与下丘脑释放的CRH和来自血液CORT呈负反馈的关系,其均有相似的节律变化规律[34-35]。因此本研究亦从HPA轴中枢控制、IL-1细胞因子、子午流注针法按时开穴等环节入手,观察按时开穴针刺对神经-内分泌-免疫系统变化的影响,来寻求针刺的最佳时机和最佳腧穴的选择[36-37],探讨按时开穴对HPA轴中各个环节的作用规律,证实HPA轴的中枢控制是子午流注针法发挥作用的机制。

本实验证明子午流注开穴组改善心理应激状态优于针刺对照组,且能够显著下调IL-1 mRNA的表达,减少CRH、ACTH、CORT的异常分泌。同时发现与心理应激造模组大鼠相比下丘脑和垂体IL-1表达明显下降。由此可见,子午流注针法促进HPA轴功能的调节,改善应激状态的机制可能与降低心理应激大鼠下丘脑和垂体中IL-1抗体免疫阳性细胞的表达有关,子午流注开穴的疗效更优于针刺穴位,这与以往研究一致[38]。

本实验有如下不足,在本实验造模期间,发现造模组大鼠和应激源电击组大鼠排便次数、便量、气味和形状较正常组有明显变化。经过治疗,子午流注开穴组大鼠和针刺对照组大鼠的排便次数、便量、气味、形状均显著改善,而造模组和应激源电击组大鼠未有改善,心理应激与排便的变化是否有直接的关联[39-41],在后期研究中,应增加对心理应激后排便变化的观察,稀便率的计算,大便常规检查,远端结肠病理组织学检查以及相关肠道免疫因子、细胞因子及基因检测,以明确二者之间的变化关系。

子午流注针法强调时间因素对针刺效应的影响,重视针灸时间效应规律性。但现代针灸临床中出现了“重用电针、舍弃传统针法”的迹象,子午流注针法几近无应用现状,开展子午流注针法临床与基础研究,是目前中医针灸学发展迫切需要解决的问题之一。因此本实验设置针刺对照组,用以比较子午流注针法与常规针法在治疗心理应激中是否具有差异性,比较传统的时间针法与常规取穴法的治疗优势。心理应激是一种慢性疾病,是很多精神类疾病的早期状态,本实验也发现该疾病的发展符合一定时间节律的变化,可见治疗有时间规律性的疾病应用子午流注针法疗效优于其他针灸方法[42],也为针灸治疗精神类疾病打下一定基础。

综上所述,子午流注开穴组对心理应激的疗效优于针刺对照组,其作用机制可能与下调IL-1 mRNA,减少诱发ACTH的分泌,传递信号参与大脑中枢调控,促进处于异常状态的HPA轴恢复正常有关,其按时开穴针刺的方法又符合中枢激素节律性分泌的规律,调节HPA轴的中枢调控水平,改善机体出现应激状态。

[1] Milrad SF, Hall DL, Jutagir DR,. Depression, evening salivary cortisol and inflammation in chronic fatigue syndrome: A psychoneuroendocrinological struc- tural regression model[J]., 2018,131: 124-130.

[2] 王寅,王洪巨.慢性心理应激大鼠模型的建立及评价研究进展[J].蚌埠医学院学报,2010,35(2):206-208.

[3] 娜琴,程飚,陈阿梅.应激动物模型构建方法及效果评价的研究进展[J].中国组织工程研究与康复,2011,15 (11):2051-2054.

[4] 王珑,张迪,田旭升,等.电针对慢性应激抑郁大鼠海马CA3区突触可塑性的影响[J].中国针灸,2017,37(2): 162-168.

[5] Luo D, Ma R, Wu Y,. Mechanism underlying acupuncture-ameliorated depressive behaviors by enhancing glial glutamate transporter in chronic unpredictable mild stress (CUMS) rats[J]., 2017,23:3080-3087.

[6] Lu J, Shao RH, Jin SY,. Acupuncture amelio- rates inflammatory response in a chronic unpredictable stress rat model of depression[J]., 2017, 128:106-112.

[7] Liu M, Zhang S, Gai Y,. Changes in the inters- titial cells of cajal and immunity in chronic psychological stress rats and therapeutic effects of acupuncture at the Zusanli Point (ST36)[J]., 2016,2016:1935372.

[8] Duan DM, Dong X,Tu Y,. A microarray study of chronic unpredictable mild stress rat blood serum with electro-acupuncture intervention[J]., 2016, 627:160-167.

[9] 谢珊.子午流注择时耳穴贴压法在抑郁症伴失眠患者中的应用及效果评价[D].南京:南京中医药大学, 2017.

[10] 胡伟峰.基于子午流注理论的刮痧疗法治疗围绝经期抑郁症的临床疗效评价[D].成都:成都中医药大学, 2015.

[11] 李琛瑛,王毅,罗云,等.子午流注针法相关文献研究分析[J].吉林中医药,2018,38(4):451-454.

[12] 黄墩兵,谷诗浓,周凡萍,等.子午流注针法治疗原发性失眠的Meta分析[J].康复学报,2018,28(1):60-66.

[13] 秦媛媛,李方远,郎琰,等.子午流注理论在失眠治疗中的应用研究进展[J].实用中医药杂志,2018,34(2): 267-269.

[14] 刘春兰,许金森.近5年子午流注针法研究概况[J].中医药临床杂志,2015,27(12):1661-1664.

[15] 贾克然,郭刚,刘开云,等.单纯心理应激小鼠模型的建立及对行为、内分泌免疫功能的影响[J].免疫学杂志, 2009,25(3):329-332.

[16] Turk MJ, Guevara-Patiño JA, Rizzuto GA,. Concomitant tumor immunity to a poorly immunogenic melanoma is prevented by regulatory T cells[J]., 2004,200(6):771-782.

[17] 余曙光,徐斌.实验针灸学[M].北京:人民卫生出版社, 2012:269-272.

[18] 卢小叶,孙冰,文钱,等.针灸治疗焦虑症的选穴规律探讨[J].上海针灸杂志,2018,37(4):474-479.

[19] 张雅萍.浅谈子午流注与时间医学[J].山西中医学院学报,2005,6(2):6-7.

[20] 邓柏颖,张剑飞,罗敏然,等.子午流注原络配穴法治疗运动性损伤及对经络状态的影响[J].中国针灸,2006, 26(10):707-709.

[21] 李光华,朱玲勤,刘红梅,等.五输穴生理电位值测定分析[J].辽宁中医杂志,2003,30(5):397.

[22] 赵越,欧阳亚萍,赵树明,等.基于数据挖掘技术探讨针灸治疗抑郁症的腧穴配伍规律[J].长春中医药大学学报,2018,34(1):176-178.

[23] 刘萍.电针对失眠大鼠焦虑抑郁情绪及交感-肾上腺髓质系统的影响研究[D].成都:成都中医药大学,2014.

[24] 吕允涛.应激的研究进展及动物模型的建立[J].新农业,2014,(23):31-32.

[25] 姚弘,魏大能,蔡定均,等.针刺对慢性情绪应激焦虑大鼠肾上腺ANP、CNP及血浆CORT水平的影响[J].中国针灸,2016,36(2):169-174.

[26] Koelsch S, Boehlig A, Hohenadel M,. The impact of acute stress on hormones and cytokines, and how their recovery is affected by musicevoked positive mood[J]., 2016,6:23008.

[27] 严灿,吴丽丽,徐志伟,等.不同治法方药对慢性心理应激大鼠下丘脑CRH mRNA表达的影响[J].中国药理学通报,2004,20(10):1164-1166.

[28] 李洁,彭丽,王杨天,等.五味子及复方中药对实验性慢性心理应激下水上漂浮并高强度运动大鼠IL-1、IL-2、IL-6影响的研究[J].实用预防医学,2011,18 (1):14-16.

[29] Tonelli LH, Postolache TT. Tumor necrosis factor alpha, interleukin-1 beta, interleukin-6 and major histocompatibility complex molecules in the normal brain and after peripheral immune challenge[J]., 2005,27(7):679-684.

[30] 魏惠芬.针灸对不同应激源所致免疫失调模型大鼠行为学及相关因子影响的实验研究[D].北京:北京中医药大学,2010.

[31] Lu J, Shao RH, Hu L,. Potential antiinflammatory effects of acupuncture in a chronic stress model of depression in rats[J]., 2016,618:31-38.

[32] 孟宏.电针对慢性应激疲劳证候模型大鼠神经免疫网络调节机制研究[D].北京:北京中医药大学,2003.

[33] Badowska-Szalewska E, Ludkiewicz B, Spodnik JH,. The influence of mild stressors on neurons containing in- terleukin-1bin the central (CeA) and medial (MeA) amygdala in the ageing process of rats[J].(), 2015,75(3):279-292.

[34] Choi KW, Na EJ, Fava M,. Increased adrenocortico- tropic hormone (ACTH) levels predict severity of depression after six months of follow-up in outpatients with major depressive disorder[J]., 2018, 270:246-252.

[35] Becking K, Spijker AT, Hoencamp E,. Distur- bances in Hypothalamic-Pituitary-Adrenal Axis and Immunological Activity Differentiating between Unipolar and Bipolar Depressive Episodes[J]., 2015,10(7):e0133898.

[36] 曹大明,路玫.按时取穴法中时辰概念之本意[J].中国针灸,2006,26(8):578-580.

[37] 陈日.子午纳支针法运用于胃经的fMRI研究[J].中国针灸,2015,35(12):1258-1262.

[38] 管遵惠,易荣,叶建,等.子午流注开穴对中风病人心肌缺血影响的研究[J].中国针灸,2005,25(11):823- 824.

[39] 赵迎盼,唐旭东,卞兆祥,等.IBS-D肝郁脾虚型病证症结合大鼠模型的建立与评价的初步研究[J].中国中西医结合杂志,2013,33(11):1507-1513.

[40] Nassar NN, Schaalan MF, Zaki HF,. Octreotide ameliorates gastric lesions in chronically mild stressed rats[J]., 2011,17(9):1135-1142.

[41] Zhou J, Li S, Wang Y,. Inhibitory Effects and Mechanisms of Electroacupuncture via Chronically Implanted Electrodes on Stress-Induced Gastric Hyper- sensitivity in Rats With Neonatal Treatment of Iodoace- tamide[J]., 2017,20(8):767-773.

[42] 马文彬,刘旭光,覃勇,等.辰时麦粒灸对RA模型大鼠炎性因子IL-6昼夜节律的影响[J].中国针灸, 2016,36(4):396-401.

Effect ofNeedling Method on the Central Regulation of HPA Axis in Psychological Stress Rat Models

1,1,2,-1,-1,-1,-3,-3,-1.

1.-,200082,; 2.,201210,; 3.,200081,

To observe the effect of(midnight-noon ebb-flow) needling method on the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis in central regulation of corticotropin-releasing hormone (CRH), adrenocorticotropic hormone (ACTH), serum cortisol (CORT) and immunologic factor interleukin (IL)-1 in psychological stress rats, and to discuss the mechanism ofneedling method in treating psychological stress.Fifty-two Wistar rats were randomized into aacupoint-opening group, an acupuncture control group, a model group and a normal group, with 13 rats in each group. The psychological stress model was developed by witnessing electric shock experiment. Theacupoint-opening group was intervened following the acupoint-opening rule of nourishing the generation inand the acupuncture control group was treated by acupuncture at Baihui (GV20). The contents of serum CORT and ACTH, the content of hypothalamic CRH, the content of pituitary ACTH and the content of CORT in adrenal gland were detected using radioimmunoassay; the expressions of IL-1 and its mRNA in hypothalamus and pituitary body were determined using immunohistochemistry and RT-PCR, respectively.Compared with the normal group, the levels of serum CORT and ACTH, the content of hypothalamic CRH, the content of pituitary ACTH and CORT in adrenal gland increased significantly in the model group (＜0.01), and the expressions of IL-1 and its mRNA in hypothalamus and pituitary body also increased significantly (＜0.01). Compared with the model group, the levels of serum CORT and ACTH, the content of hypothalamic CRH, the content of pituitary ACTH and CORT in adrenal gland decreased significantly in theacupoint-opening group (＜0.01) and the expressions of IL-1 and its mRNA in hypothalamus and pituitary body also decreased significantly (＜0.01). Compared with the acupuncture control group, the levels of serum CORT and ACTH, the content of hypothalamic CRH, the content of pituitary ACTH and CORT in adrenal gland decreased significantly in theacupoint-opening group (＜0.05) and the expressions of IL-1 and its mRNA in hypothalamus and pituitary body also decreased significantly (＜0.05).acupoint-opening acupuncture can regulate the secretion of CRH, ACTH and CORT in psychological stress rat models and promote the recovery of the HPA function. The mechanism is possibly associated with the down-regulation of IL-1 mRNA, reduction of the ACTH production and inhibition of the signal transduction to the central system.

needling method; Psychological stress; HPA axis; Central regulation; IL-1; Rat

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2020.01.0075

1005-0957(2020)01-0075-09

2019-06-18

上海市卫生和计划生育委员会项目(2014659);上海市虹口区“国医强优”三年行动计划项目;上海中医药大学附属上海市中西医结合医院教学项目(QK-04)

王毅(1983—),女,主治医师,Email:shennong-923@hotmail.com

胡智海(1975—),男,主任医师,硕士,Email:zhh1708@hotmail.com