肝细胞癌实时超声造影灌注参数与肿瘤微血管的相关性

谢国平，何志忠，李霞

作者单位：东莞市人民医院超声科，广东 东莞 523059

肝细胞癌（HCC）是一种常见的恶性实体肿瘤，恶性实体肿瘤具有血管依赖性病变的特点，肿瘤新生血管在癌细胞的生存、发展和转移过程中起重要作用，是肿瘤生长、增殖的前提，而用来衡量肿瘤血管生成的标准为肿瘤微血管密度（MVD）［1-2］。有研究显示［3］，肿瘤新生血管越多，瘤组织生长越活跃，且在发展过程中会不断释放生成因子，诱发新生血管形成，导致恶性循环。新生血管的不断增加会使得血管通透性增加，血流灌注量随之发生改变，在超声造影成像下能看到显著变化［4］。为此，选择40例HCC病人进行此次研究，旨在探讨HCC实时超声造影灌注参数与MVD的相关性，并评价其临床应用价值。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料选择2017年6月至2018年10月在东莞市人民医院进行诊治的40 例HCC 病人作为研究对象。所有病人均经手术或病理学检测为HCC，病人或近亲属均自愿签署研究知情同意书。其中男27例，女13例；年龄范围为33～67岁，年龄（44.3±6.1）岁；肿瘤直径范围为1.9～11.4 cm，直径（5.7±2.2）cm。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 方法

1.2.1 仪器和造影剂 仪器选用西门子S2000彩超仪，4C 造影探头，频率设置为2～4 MHz。配备配备对比脉冲系列成像技术（CPS）造影软件、自动追踪造影定量分析（ACQ）软件和声学定量时间-强度曲线（TIC）分析软件。机械指数设置为0.08，深度、增益及TGC等仪器条件在造影过程中保持不变。

造影剂采用SonoVue干粉剂［上海博莱科信谊药业有限责任公司（瑞士进口），国药准字J20080052］，使用时用5 mL的生理盐水进行稀释并振荡摇匀，配制成SF6微泡悬浊液，用量2.4 mL。

1.2.2 方法 进行超声造影前，先在二维超声下对病人的病灶进行观察，记录病灶的位置、大小、数目及回声特征，并用彩色多普勒及能量多普勒对其血流分布特征进行显示。启动CPS 技术，切入造影状态，经肘静脉团注造影剂2.4 mL，随后注入5 mL 生理盐水，同时启动仪器进入造影状态，实时观察病灶及周围肝组织的增强情况，记录造影全过程并存盘，造影过程持续6 min。

1.2.3 分析图像 根据整个病灶的整体平均强度绘制出TIC，在曲线上读取达峰时间，将读取时刻的静态增强图像作为研究对象。用PS7.0图像处理软件对平均血流密度（MFD）进行计测：计算增强面积占肿瘤有效面积的比例（肿瘤有效面积＝总面积－液化坏死区面积）。使用统一取样框对病灶增强最明显处及病灶同一水平位置的正常肝实质取样，样框大小设置为6 mm×6 mm，对HCC 和TIC 进行绘制，并计算病灶峰值的绝对增强强度（AEI＝病灶峰值强度值－同一时间正常肝实质增强强度值）。进入ACQ程序后，选择8 mm×8 mm大小的病灶内最明显强化部分设置为感兴趣区（ROI），通过TIC反映每个ROI 内造影剂增强效果，得出病灶及癌旁组织的达峰时间（TTP）和峰值强度（PI）并记录。

1.2.4 测定MVD 手术后标本切片，严格遵守试剂使用说明进行免疫组织化学染色，染色方法选用抗CD34 单克隆抗体SP 法。先在100 倍光镜下对整个切片进行扫查并选出5个血管高密度区作为研究对象，然后在400倍光镜下进行计数，统计出染色呈阳性的血管数，每个被染成棕黄色或棕褐色，并且在肿瘤细胞组织中与肿瘤组织和邻近微血管分界清楚的内皮细胞或细胞簇团都应认为是新的肿瘤血管，可以作为1个微血管进行计数，取5次计数的平均值作为MVD值。

1.3 观察指标①造影后定量分析峰值时间增强图像，记录所有病人的平均血流密度（MFD）；②用TIC 定量分析后，记录所有病人的病灶绝对增强强度（AEI）、肝癌及癌旁组织的达峰时间（TTP）和PI；③用Pearson相关分析法对以上记录数据和MVD进行相关性分析。

1.4 统计学方法选择SPSS18.0进行数据统计，数据采用来表示，计量资料的比较采用t检验，计数资料表示为例（%），比较采用χ2检验，用Pearson相关分析法进行超声造影灌注参数和MVD 的相关性分析，当P＜0.05时，差异有统计学意义。

2 结果

2.1 40例HCC病人的病灶绝对增强强度值和平均血流密度值所有病人的病灶增强达峰时间均在动脉相内，在病灶增强峰值时间测量的MFD 值为（0.78±0.15）；根据TIC定量分析结果，计算出在病灶峰值增强时间的AEI值为（7.43±3.54）dB。见图1、2。

图1 肝癌病例肝脏超声造影时间-强度曲线图

图2 肝癌病例肝脏超声造影同一病灶达峰时间静态增强图像

2.2 40 例HCC 病人HCC 和癌旁组织的达峰时间和峰值强度TIC曲线的运动趋势表现为上升支陡直，且迅速达峰，峰值前移。所有病人的TTP 为（14.24±5.11）s；PI值为（43.11±10.25）dB。见图3。

图3 肝癌病例肝脏超声造影时间-强度曲线（TIC）图显示达峰时间（TTP）和峰值强度（PI）

2.3 40 例HCC 病人超声造影灌注参数与MVD 的Pearson 相关分析结果Pearson 相关分析显示，MFD、PI 与MVD 呈显著正相关（P＜0.05），TTP 值与MVD 呈显著负相关（P＜0.05），AEI 与MVD 之间不具备相关性（P＞0.05）。具体数据见表1。

表1 肝癌病例肝脏超声造影灌注参数与MVD的Pearson相关分析

3 讨论

恶性肿瘤生长的一个明显特征是血管生成依赖性，即新生血管是肿瘤快速生长的前提［5］。新生血管不仅为癌细胞生长提供营养，帮助排除代谢废物，而且能够帮助癌细胞进行扩散，其生成、增殖会促进癌细胞进入血液循环，因此新生血管是HCC 生长、侵袭、转移的基础［6］。新生血管增多使得血液营养丰富，促进瘤组织生长，且瘤细胞在发展过程中会不断释放血管生成因子，反向促进新生血管增多。有研究表明，新生血管具有以下特点：数量明显增加；有异常血管网结构，分支紊乱；基底膜不完整，通透性较大［7-8］。新生血管的这些特点是的其会引起血流灌注量的改变，这也是超声造影显像的原理。

超声造影技术能够实时不间断观察病灶的增强特点，并且对增强过程中的细节进行精确捕捉，是目前临床上最先进的超声技术之一［9］。此外，由于造影剂停留在血管内，能够精确的对新生血管的血流灌注状态进行反映，对肿瘤的供血信息和血流灌注信息能够得到较为全面的掌握。衡量新生血管的一个重要指标为MVD，其与肿瘤的生存、发展及转移关系密切。HCC的血供丰富，测定MVD是反映其血管生成的一种较为准确的手段［10-11］。有研究表明，超声造影检测出的新生血管的多少，能够对肿瘤组织的血供需求量进行反应，瘤组织的恶性程度越高，生长越快速，血供需求量就越大，单位体积内的血管数量就越多，超声造影反应出的增强效果越明显，而增强效果则能够反映肿瘤的MVD［12-13］。因此，为探讨超声造影灌注参数与MVD 的相关性，我院进行此次研究。

HCC 主要以肝动脉进行供血，血流灌注量大，流速快，会使得造影剂微泡灌注量增加，回声反射强烈［14］。本次研究中，经TIC定量分析显示，灌注参数中的TTP 与MVD 呈显著负相关，PI 与MVD 呈显著正相关，可通过其反应病人的MVD 水平，从而了解HCC血管的新生情况。MVD的数值越大，说明病人的新生血管越多，血供越丰富，促使进入瘤内的造影剂微泡增多，使得血中小界面增加，产生较为强烈的回声反射，血液流速增快，肿块回声增强，最终显示为PI强，TTP快［15］。

此外，本研究还测定了MFD、AEI来反映肿瘤的微血管数量。研究结果显示，MFD 与MVD 呈显著正相关，AEI与MVD不具有相关性。

其原因为肿瘤的生长迅速使得瘤细胞血供丰富，致使其微血管密度增加，因此在进行超声造影过程中，肿瘤组织内微泡的数量增多，最终显示为增强部分占肿瘤有效面积的比例就越大，因此MFD 与MVD 呈正相关。有学者认为AEI 可以作为评估肿瘤血管生成的指标，其对50 个肝细胞性肝癌病灶进行超声造影检查，检查结果显示，AEI 与免疫组化染色所得MVD 呈正相关［16］。但我院本次研究中数据显示，AEI 与MVD 之间并不具备相关性，可能是由于实际操作过程中，由于病人的呼吸使得取样框的固定在同一特定位置的难度较大，造成误差；也可能是因为本次研究的样本容量较小。

综上所述，实时超声造影灌注参数PI、TTP 及MFD 与MVD 的表达具有良好的相关性，能够作为定量评价肿瘤血流生成状况的可靠指标，具有临床应用价值。