棕色化反应的理论与实践

（甘肃省烟草公司陇南市公司，陇南 746000）

棕色化是指植物体由本色变为棕色或深褐色的过程。在自然界造成植物体棕色或深褐色的因素较多，有棕色化反应、高温碳化、焦糖化以及高湿条件下微生物参与的腐败反应等。一般所说的棕色化是指棕色化反应。长期以来许多学者对棕色化反应进行了大量研究，并将成果应用到实践中，为丰富人类物质生活做出了积极的贡献。特别是在烟草的加工储藏、茶叶制作、果蔬的加工储藏、食品加工等方面具有重要作用。但由于棕色化反应的复杂性，人类对棕色化反应的认识还不全面，因此探寻棕色化反应机理，寻找棕色化反应发生的核心要素对人类认识棕色化反应规律，人为定向调控棕色化反应，造福人类具有积极的意义。

1 棕色化反应研究与应用现状

棕色化反应包括酶促棕色化反应和非酶棕色化反应两类。酶促棕色化反应必须在多酚氧化酶（PPO）的催化作用下才能进行。而酶是由活细胞产生的、对底物具有高度特异性和高度催化效能的蛋白质或RNA，若酶分子变性或亚基解聚均可导致酶活性丧失。非酶棕色化反应又称美拉德反应，不需要酶的参与就可发生。

在果蔬加工储藏过程中，农产品的酶促褐变不仅影响产品外观、风味、营养和加工性能，尤其对肉色较浅且容易碰伤的水果和蔬菜影响更为严重，造成的经济损失更大［1，2］。同时酶促褐变也是新鲜蔬菜如莴苣、土豆和果汁颜色变化，营养和口感变劣的主要原因［3］。在烟叶的烘烤过程中酶促褐变不但造成烟叶挂灰、蒸片、黑糟，还使叶片破碎度加大、燃烧力减弱、香气减少、杂气增加，外在质量与内在品质下降。在绿茶制作中酶促褐变以及储藏中的美拉德反应都会造成维生素C、茶多酚、咖啡碱、叶绿素含量下降，色泽、汤色、香气质变差。棕色化反应也有有利的一面。红茶是全发酵茶，PPO可以催化氧化儿茶素类物质形成茶黄素类色素，茶黄素类色素对红茶色、香、味等品质的形成具有关键作用。在制作速溶红茶时，PPO可增加可溶性物质的含量，提高制作率，减轻红茶的苦涩味，提高速溶红茶的风味品质［4，5］。普洱茶和烟叶在储藏陈化过程中的美拉德反应能够减少杂气，使香气更浓郁［6］。食品加工中的美拉德反应可以使烤制出的面包、烤肉等食品色香味俱佳，使苹果酒、椰枣、葡萄干更香甜［7］。

1.1 酶促棕色化反应研究与应用现状

在果蔬储藏加工、茶叶制作、烟草加工等方面酶促棕色化反应普遍发生。普遍认为：酶促棕色化反应主要是指绿色植物果实、块茎、叶片细胞中含有多酚类物质，在细胞组织结构完整时多酚类物质、PPO、氧气各处于一定的区隔，不容易接触，很少发生酶促棕色化反应，而且在细胞处于生命活动较旺盛状态时，多酚类物质既进行氧化作用又进行还原作用，氧化还原反应能够保持平衡［8］。在烟叶烘烤中，当由变黄阶段转入定色阶段，叶组织逐渐死亡，细胞结构开始自溶和解体，细胞膜透性增大，使多酚类物质、氧气可以自由进出细胞组织，PPO、多酚类物质、氧气很容易接触，多酚类物质只能被氧化，很少被还原，使多酚类物质被迅速氧化成醌类，醌聚合与细胞内蛋白质的氨基酸反应产生黑色素沉淀。由于多酚类物质是构成果蔬、烟叶、绿茶中香吃味的重要物质，多酚类物质的含量与其品质和芳香吃味是一致的，因而酶促棕色化反应的发生会造成果蔬、烟叶、绿茶等经济作物质量的下降。Johnson等人研究发现［9］，一旦烟叶颜色完全变褐，多酚类物质含量就会减少85%，烟叶的芳香吃味因此而变差，杂气加重。在烤烟烘烤过程中烟叶酶促棕色化反应往往发生于变黄时间过长或定色太晚的情况下，此时除具有良好的氧化条件外，也与糖分消耗过度，使葡萄糖提供氢将醌还原的能力降低有关，导致醌类物质积累、颜色变深。在晾晒烟调制过程中由于温度较低，烟叶变黄变褐的时间较晚，一般在10～20 d，但其步骤是相同的，在变黄前一般不发生酶促棕色化反应。

1.1.1 影响酶促棕色化反应发生的内部因素

影响酶促棕色化反应的内在因子有：植物细胞组织内的多酚含量、细胞组织结构损坏程度、细胞组织的含水量、PPO活性。

（1）植物细胞组织内多酚含量及变化。植物多酚广泛分布于蔬菜、水果、豆类、谷物类、烟草、茶等植物中，以苹果、香蕉、马铃薯、茄子、莲藕、咖啡、烟草、茶叶中含量较高。据王岩等［10］研究，花牛苹果果皮及果肉中多酚含量分别为11.31、1.63 mg/g，成熟苹果中的多酚主要为绿原酸、儿茶素以及原花青素等。据赵霖等［11］研究，江西婺源县3月份采摘的绿茶中多酚含量达228.22 mg/g。Johnson等［9］研究表明，烟叶中多酚类物质含量一般在1.8%～5.2%，烟叶中的多酚主要为咖啡酸、绿原酸、芸香苷等。在不同生长期多酚含量也发生着变化，柿果实在花后35～50 d达到最高水平［12］，随后逐渐降低，烟叶叶片随着叶龄的增加而增加，在叶龄70 d时达到峰值［13］。

（2）细胞组织结构损坏程度。在细胞组织结构完整的情况下，苹果、马铃薯、烟草、茶叶等并不发生棕色化反应，但在细胞组织死亡时，如苹果、马铃薯切片，以及当烟叶变黄后如温度超过45℃，细胞结构遭到破坏，细胞膜的选择透性逐渐丧失，膜透性增大，将导致：一是原生质大量外渗；二是氧自由进入细胞组织；三是细胞内各种物质与酶混杂在一起，从而导致酶促棕色化反应发生［14］。

（3）细胞组织含水量。细胞组织内水分状况决定着酶促棕色化反应强弱，是酶促棕色化反应能否发生的必要条件。一般认为［15，16］，烟叶变黄末期，烟叶含水量大于原来含水量的50%，就为酶促棕色化反应的发生奠定了基础，含水量小于原来含水量的50%，酶促棕色化反应就很难发生。对于马铃薯、苹果等含水量较多的块茎和果实，干燥环境较湿润环境其酶促棕色化反应发生的强度较弱。

（4）PPO活性。PPO是一类普遍存在于植物叶片、组织中，由核基因编码，能与铜相结合的金属蛋白酶［17］。PPO能催化邻苯酚与氧结合生成邻苯醌，一般植物幼嫩部分含量高。温度是影响PPO活性的重要因素。温度对PPO的活性主要产生两个方面的影响：在适宜温度范围内，随着温度的上升，PPO活性上升，但当超过最适温度后，随着温度的上升，PPO活性下降，同时伴随着PPO浓度下降。即温度对PPO活性和浓度具有双重影响。孙荣［18］测定了鲜切苹果在0、4、20、25℃储藏条件下PPO活性，结果表明在20℃和25℃储藏条件下PPO活性最高，在4℃储藏条件下PPO活性最低。宋金隆等［19］对苹果、鲜茶叶及马铃薯的对比研究表明：苹果、鲜茶叶及马铃薯PPO的最适温度分别为25、30、30℃。戴亚等［20］研究发现，PPO在20～50℃范围内保持着较高的活力，并且其活性均在40℃左右最高，在40℃以下PPO是相当稳定的，但当温度超过55℃时，易迅速钝化失去活性。雷东锋等［21］研究认为，35℃时烟草PPO活性最高。韩富根等［22］发现，当温度在55℃以上时，PPO活性就会迅速下降，当温度超过75℃，5～7 s可使PPO钝化。总之温度不同，PPO活性强弱不同，果蔬中PPO的最适温度为常温，但在烟叶烘烤中认为PPO在温度45～50℃，相对湿度60%以上时被活化，在温度55℃，相对湿度60%以下时受到抑制。

1.1.2 影响酶促棕色化反应发生的外部因素

在正常情况下绿色植物果实、块茎、叶片等很少发生酶促棕色化反应。当储藏时间过长或切开，以及烟叶、绿茶等在烘烤炒制过程中技术操作不当时，将会诱导酶促棕色化反应的发生。在25℃下，苹果、马铃薯、茄子等切开后30 min即发生棕色化变褐。有研究发现，在烘烤环境温度低于44℃时烟叶变褐速度极为缓慢，当升高到57℃时，仅6 min棕色化反应过程就可全部完成［9］。绿茶在炒制中首先要杀青，要求杀青时叶温达到80℃以上，目的是将PPO高温钝化，防止炒制过程中的变褐，而普洱茶杀青时叶温不超过65℃，只是钝化了部分活性酶，接下来的揉捻、晒青过程会发生酶促氧化和发酵反应［23］。诱导植物细胞组织酶促棕色化反应的外部因素有两个：一是环境温度，二是环境相对湿度。两者结合影响植物细胞组织含水量和PPO活性，从而促进或制约酶促棕色化反应的发生。一般认为；当烟叶变黄后，如温度超过44℃、相对湿度60%以上、烟叶失水量少于50%三个条件同时具备时将导致酶促棕色化反应的发生［16］。

1.1.3 对酶促棕色化反应的调控

调控酶促棕色化反应发生主要有六个途径。一是调控多酚类物质的含量。通过品种选育、合理的农业栽培措施等，可以降低多酚类物质的含量。二是降低PPO的活性。如温度调控，果蔬储藏过程中的温度设定在4℃、绿茶炒制中的高温杀青使PPO钝化，以及高压、辐射和超声处理等破坏酶促反应赖以发生的生理生化环境，从而降低PPO活性。三是酸处理。韩富根［22］通过试验表明，酶促褐变最适宜的pH范围在4～7之间，降低或提高介质中的pH，可以控制PPO的活性，抑制其催化作用。四是酶抑制剂。李尼杭等研究指出，烟叶烤前用抑制剂处理能使多酚含量达到人们所要求的范围。五是驱氧，造成缺氧环境。在果蔬的储藏运输中充入二氧化碳可以抑制酶促褐变；在烟叶烘烤中降低房内氧气浓度可有效减少棕色化反应的发生。Watkins等［24］研究指出，烟叶烘烤过程中，当氧气浓度在0.01%时，酶促褐变基本上不会发生；当氧气浓度高于0.5%时，随着氧气浓度的增加，烟叶褐变程度逐渐加重。六是减少与金属物接触（铁、铜）。铁、铜等是PPO激活剂，能促进褐变主要是因为铁和铜能够和酚类化合物反应形成褐色物质，还能催化还原酮类的氧化，这是用铁刀切的苹果、茄子易变褐的原因。在烟叶烘烤上普遍认可的调控酶促棕色化反应的方法是；烟叶基本变黄后，在温度45℃以前，失水超过50%，进入定色阶段后，缓慢升温，加快排湿，达到烟叶小卷筒，定色阶段保持60%以下的相对湿度可以防止烟叶氧化变褐［14］。

1.2 美拉德化反应研究与应用现状

美拉德反应是指氨基酸与糖类之间的缩合反应。它不需要酶的参与就可发生，是面包、烟叶、茶叶香气成分形成的重要过程。在烟叶陈化过程中，美拉德反应形成的阿马杜里化合物占干重的2%～3%，一般认为这些产物可以赋予烟叶特有的香气。普遍认为美拉德反应是氨基酸与还原糖的羰基缩合，形成氨基糖经阿马杜里和海茵氏重排得到中间物，产生糖醛类和还原酮类或脱氧还原醛类，并经环化或裂解成各种香气物质。影响美拉德反应的因素：一是pH值，pH值在7～11之间有利于美拉德反应的发生；二是温度，温度越高反应越快，低于80℃时反应不明显，当高于100℃时反应加快；三是糖，随着糖浓度的增加反应速度加快；四是金属离子，二价铁离子和二价铜离子存在的情况下，褐变速度加快；五是水分，水分在10%～15%时最易发生褐变；六是氧气，氧气充分时易发生褐变。美拉德反应在生产生活中非常普遍。人类利用美拉德反应实例很多，如烤面包、烤肉、熏鱼、红酒酿制等，在红烧肉制作过程中肉中的还原糖和氨基酸、肽、蛋白质发生美拉德反应形成风味物质，生成具有肉香味的化合物，色香味俱佳。在烤烟的复烤、晾晒烟的晾制、发酵及陈化、卷烟的烘焙、卷烟的燃吸以及普洱茶储藏陈化中美拉德反应能够减少杂气，使香气更浓郁。

2 棕色化反应认识上存在的问题

经过长期研究，人们对棕色化反应机理取得了一定认识，但仍然不够深入，特别是对酶促棕色化反应的认识存在许多问题。一是对PPO活性温度认识有差距。如苹果在25℃条件下PPO活性最高，在4℃储藏条件下PPO活性最低，鲜茶叶、马铃薯PPO最适温度为30℃。在烟草上，戴亚等［20］认为40℃左右PPO活性最高，而雷东锋等［21］等认为35℃时PPO活性最高，但在此温度范围内一般并不发生棕色化反应。韩富根等［22］认为，当温度在55℃以上时，PPO就会迅速钝化失去活性。而有人认为，当温度升高到57℃时，仅6 min棕色化反应过程就可全部完成［9］。经典教科书中认为烟叶烘烤中PPO在温度45～50℃时被活化。但在叶片受伤以及晾晒烟晾制过程中，常温下也发生褐变。二是对酶的氧化性研究较多，而忽视了酶的还原性［25］。三是细胞组织的死亡温度。传统认为植物细胞组织致死环境温度为50～52℃，超过此温度，细胞趋于死亡，但生长的植物超过此温度时细胞组织并不死亡。在烟叶烘烤上操作不当时，在50～52℃前褐变已经发生［25］。四是忽视了能量代谢的作用。酶促棕色化是一个可逆过程，还原反应需要吸收能量，能量变化与酚还原成醌的相关性如何？五是在酶促棕色化反应的调控上，很多方法实施难度大、成本高、甚至造成新的伤害。六是对发生烟草酶促棕色化反应的条件以烤房内温度、相对湿度等外部条件为主，没有揭示出烟草酶促棕色化反应的核心要素。七是酶促棕色化反应发生条件的结论具有片面性，不同研究结论之间关联性不高，甚至相互矛盾。如在烟草上认为44℃以下不发生酶促棕色化反应等。八是对PPO的认识不全面。认为PPO的作用是催化酶促棕色化反应，没有认识到PPO首先是呼吸酶，其在细胞组织呼吸中的作用。九是对PPO同工酶的种类及不同时期、不同条件下的协同作用研究少。十是当多酚含量达到峰值后多酚类物质的降解机理研究较少。十一是我国经典教科书中棕色化反应化学式［8］不正确，邻苯醌的苯环上碳原子和氧原子共价键不符合基本科学原理（图1）。

图1 经典教科书中酶促棕色化反应化学式

3 棕色化反应理论的再认识

植物多酚是多羟基酚类化合物的总称，其广泛分布于蔬菜、水果、谷物、烟草、茶等植物中。它在植物体的叶、木、皮、壳和果肉中均有一定含量［26］。人类最早认识多酚是由于其能与蛋白质结合或与消化道内的酶结合降低蛋白质的消化性，影响营养成分的吸收，引起便秘等消化不良症状，以及造成果蔬褐变变质等不利因素。随着研究的不断深入，人类认识到多酚是植物体内的重要代谢产物，具有抗氧化、抗衰老、抗紫外线、保湿等作用，对多种细菌、真菌、酵母菌都有明显的抑制作用，对增强植物抗性具有积极的作用［27］。在绿色植物生长过程中如遇病虫害侵染、恶劣环境、机械损伤等不利因素时植物通过棕色化反应造成局部坏死，以恶化病虫害侵染环境，在受伤部位形成保护层。在种子成熟前核桃、苹果、柿子、梨等果实的外皮含有大量的酚类使果实吃起来苦涩难咽，确保了种子成熟，而在果实成熟后酚类降解或转化成为香气物质，使果实香甜、色泽艳丽，以吸引动物将种子扩散、生命得到延续［28］。而美拉德反应会赋予食品诱人的色泽及特殊的风味，给人类带来视觉、味觉及嗅觉的享受。一般在果蔬储藏运输中发生的棕色化反应为酶促棕色化反应，食品加工中发生的棕色化反应为美拉德反应，而烟草的加工储藏、茶叶制作储藏中既有酶促棕色化反应，又有美拉德反应。

3.1 棕色化反应机理探究

虽然在发生酶促棕色化反应植物组织细胞内都含有多酚类物质、PPO、氧气，但植物生长及衰老过程中一般并不发生棕色化反应，这主要是由PPO的性质和多酚类物质、PPO、氧气所处位置决定的。首先，PPO是一种呼吸氧化酶，与细胞色素氧化酶、黄酶等共同参与细胞组织的呼吸作用。PPO对氧的亲和力较弱，其在高氧条件下效率较高。因而PPO在生长过程也参加呼吸氧化反应，只是强度弱，是多酚物质在组织体内降解的途径之一，也是多酚物质含量在达到峰值后其含量下降但没有变褐的原因。而且PPO不具有还原性、不可能将邻苯醌还原成邻苯酚。其次，在生长和衰老过程中细胞组织结构完整，多酚类物质、PPO、氧气各处于一定的区隔，不容易接触。三者相互接触是酶促棕色化反应发生的关键。只有细胞组织结构解体才能让三者相互接触。细胞组织结构解体的途径有两种：一是细胞组织结构的损伤，如植物组织受病虫害侵染、机械损伤、冻害或高温伤害；二是细胞组织衰老后的程序性死亡。在自然界由于组织结构的损伤而发生酶促棕色化反应的现象很多，如赤星病病斑、斑须蝽刺吸口器造成的黑斑、马铃薯切块后变褐、叶片伤口变褐、果蔬受冻害后变褐、叶片冻害后形成的水煮叶、叶片高温伤害形成的蒸片等。当细胞组织衰老后细胞组织的抗逆力下降，如细胞组织温度升高，细胞膜及类囊体膜上的蛋白质变性失活，或随着细胞组织的程序化死亡，膜透性增大，膜的选择透性逐渐丧失，组织结构解体，酶促棕色化反应随之发生。在衰老死亡方面，马铃薯、香蕉由于存放时间过长会引发褐变。在烤烟烘烤中叶片变黄后，湿烟叶组织温度超过38℃［25］（变黄后湿烟叶组织细胞致死温度为38℃），如叶片失水率不超过50%，会导致酶促棕色化反应发生。但在烤烟、晾晒烟变黄后，如叶片失水率不超过50%，即使湿烟叶组织温度不超过38℃，但随着细胞组织的程序化死亡也伴随细胞组织结构的解体，叶片变褐。因此细胞组织结构的解体是发生酶促棕色化反应的充要条件（图2）。

图2 酶促棕色化反应化学式

美拉德反应是氨基酸与糖的缩合反应，在自然界普遍发生，如烤烟的复烤、陈化、晾晒烟的晾制以及普洱茶储藏陈化、食品的烤制都是美拉德反应。高温高湿能加快美拉德反应的发生，如烤制面包、烤肉时发生美拉德反应只需几十分钟，在烟叶的复烤、烟丝烘焙中需采用高温高湿，而卷烟吸燃过程的美拉德反应则用微秒计算。晾晒烟变黄后在凋萎过程中发生轻微的变褐现象，其主要变褐发生在烟叶凋萎后，在凋萎过程中发生的变褐主要是酶促棕色化反应，而在凋萎后发生的变褐主要是美拉德反应，由于晾晒过程中温度较低反应慢，所以晾晒过程比烘烤过程更耗时。对于烟叶的自然陈化，低温干燥的西北地区比温湿度高的江南地区要慢。普洱茶老叶带梗需陈化更长时间。

3.2 棕色化反应的调控

在生产生活中要阻止酶促棕色化反应就必须防止细胞组织结构的解体。首先要减少细胞组织结构的损伤，如及时防治植物生长过程中病虫害的发生、减少人畜对植物的机械损伤、防止早春和晚秋的冻害、减少果蔬加工储藏运输中的破损及温度过低造成的冻害。在烟叶、绿茶的采摘调制过程中减少机械损伤、在堆放过程中避免高温、烤房内装烟要均匀避免局部过密出现高温等。其次要降低细胞组织衰老死亡的速度，如在低温（4℃）或低氧条件下储藏运输果蔬，可降低其代谢水平，延缓衰老死亡的速度，并在其衰老死亡前将果蔬出库销售。对于需长期储藏的荔枝等多汁水果就必须将温度降到0℃以下并配合200 kPa左右的气压，如果在常压下储藏温度低于0℃，随着体内水结冰体积增大会破坏细胞结构，只有在高压下体积不变并形成均匀的冰晶，才不会损伤细胞组织结构。当细胞组织结构的解体不可避免时，可以通过改变环境阻止酶促棕色化反应的发生。如切块的苹果、马铃薯可以放置在水中（隔氧）或用水漂洗（多酚、PPO溶入水中）可以降低酶促棕色化反应的发生。在烟叶烘烤中当烟叶变黄后快速失水让烟叶达到充分凋萎，在主脉发软（失水30%）前组织温度不超过37℃，在定色期烟叶小卷筒（失水50%）前烟叶组织温度不超过38℃，就是要在烟叶衰老变黄后细胞组织解体前通过失水的方式将原生质变为凝胶，PPO失去活性，同时终止细胞组织的程序化死亡，否则就可能发生酶促棕色化反应，烟叶变褐，质量下降。在绿茶的制作中通过高温杀青在细胞组织解体前钝化PPO活性，以阻止炒制过程中酶促棕色化反应，如高温杀青不彻底，炒制出的绿茶颜色就会发暗，品质下降。在美拉德反应方面，人类通过高温或高湿加快美拉德反应的速度，如烤肉、烤馍等，而且通过在红烧肉中加糖、在面包表面抹一层蛋液等方式增加美拉德反应的强度，使制作出的食品色香味俱佳，在晾晒烟晾制过程中通过增加湿度来增加晾晒烟的香气与色度。将绿茶存放在温湿度低的冷藏柜中以阻止美拉德反应，绿茶品质会得到有效的保存，而普洱茶放在干燥、无光、通风处即可。

4 展望

由于棕色化反应的复杂性，棕色化反应机理以及反应过程的中间产物等许多问题尚不清楚。如植物在衰老过程中多酚的降解产物等。随着现代生物技术的进步，必将对棕色化反应分子生物学的发展带来新的契机。而且通过转录组学、蛋白质组学以及代谢组学研究，将会对棕色化反应分子机理的认识进一步深入，最终揭开棕色化反应的神秘面纱。