人参、鹿茸水提物配伍前后对D-半乳糖致衰老小鼠的影响

崔长升 史秋萍 许宁 齐滨 王任晶 杨洋 张羽 赵大庆 刘莉

(1长春中医药大学药学院，吉林 长春 130117；2吉林省人参科学研究院)

人参鹿茸的配伍应用历史悠久，《普济方》中含参、茸的方剂有116首〔1〕。参茸颗粒收载于国家中成药标准汇编。具有补心气，益心肾的功效，用于体虚神祛，心悸气短，腰膝酸软，阳痿遗精〔2〕。由于含参茸产品制剂安全无毒〔3，4〕，参茸产品开发方面备受人们关注。近年来，大量研究表明人参和鹿茸都具有抗氧化活性，但都主要集中于单味药的抗氧化研究〔5，6〕，二者配伍后抗氧化活性的研究未见报道。本实验主要通过设计人参水提液(GA)、鹿茸水提液(PA)、人参和鹿茸水提物配伍(GPA)三组试验探讨三者对D-半乳糖致衰老小鼠的保护作用。

1 材料及方法

1.1实验材料 人参购于吉林抚松。鹿茸为梅花鹿鹿茸，购于吉林双阳。ICR种小鼠，雄性，体重(22±2)g，SPF级，批准号：SCXK(吉)2016-0003，购于长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(CAT)、还原性谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)测试盒购于江苏酶免实业有限公司；D-半乳糖，上海惠世生化试剂有限公司；其他试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

1.2实验仪器 离心机(TDL-80-2B型，上海安亭科学仪器厂)；酶标仪(Infinite M200 Pro型)；石蜡切片机(RM2235型，德国莱卡测量系统设备有限公司)；自动包埋机(EG1150H型，德国莱卡测量系统设备有限公司)；烘片机(HI1220型，德国莱卡测量系统设备有限公司)；铺片机(HI1210型，德国莱卡测量系统设备有限公司)；体视显微镜(SMZ25型)。

1.3实验方法

1.3.1样品的制备 人参粉碎，过80目筛。取50 g粉末，加入8倍水煎煮2 h，滤过，滤渣加6倍量水煎煮1 h，合并滤液，蒸干即得GA。鲜鹿茸剪碎，取50 g，加入8倍水煎煮2 h，滤过，滤渣加6倍量水煎煮1 h，合并滤液，蒸干即得PA。将GA与PA按1∶1的比例混合即得GPA。

1.3.2小鼠分组及处理 将60只小鼠适应性饲养1 w，随机分为正常对照组、模型对照组、GA组、PA组、GPA组，每组10只。除正常对照组外，其他各组腹腔注射D-半乳糖，剂量为150 mg/(kg·d)，以体质量计，下同；正常对照组的小鼠注射等体积生理盐水；GA、PA、GPA组分别给予100 mg/(kg·d)的GA、PA、GPA灌胃，正常对照组及模型对照组则等体积的生理盐水灌胃，持续处理42 d。

1.3.3小鼠实验样本的采集 第42天给药12 h后(禁食不禁水)，称质量。采用摘眼球取血，脱颈处死，收集血清，低温保存，用于血清生化指标测定。提取肝脏和脑组织，一部分肝脏及右脑匀浆，按照器官1∶9(m/V)的比例加入冷生理盐水，匀浆器冰浴研磨制备成10%的肝组织匀浆，3 500 r/min、4℃离心10 min，取上清液，低温保存，用于组织生化指标测定。另一部分肝脏及左脑于4%多聚甲醛中固定，用于组织切片观察。

1.3.4生化指标测定 血清、肝、脑组织匀浆的SOD、GSH、CAT和MDA含量测定均按照试剂盒说明书的方法进行。

1.3.5组织切片观察 从4%多聚甲醛固定液中取出肝、脑组织，脱水，透明，包埋，制作石蜡切片，苏木素-伊红染色，中性树胶封片，于显微镜观察。

1.4数据处理 采用SPSS19.0软件进行方差分析。

2 结 果

2.1GA、PA、GPA对D-半乳糖致衰老小鼠血清SOD、CAT 、GSH和MDA含量的影响 与正常对照组比较，模型对照组小鼠血清中SOD、CAT、GSH含量明显降低，MDA含量升高(P<0.01)，表明小鼠衰老模型建立成功。与模型对照组比较，GA组、PA组、GPA组SOD、CAT、GSH的含量明显升高，MDA含量明显降低(P<0.05,P<0.01)。见表1。

表1 GA、PA、GPA对D-半乳糖致衰老小鼠血清SOD、CAT、GSH和MDA含量的影响

与正常对照组比较：1)P<0.01；与模型对照组比较：2)P<0.05，3)P<0.01，下表同

2.2GA、PA、GPA对D-半乳糖致衰老小鼠肝脏SOD、CAT 、GSH和MDA含量的影响 与正常对照组比较，模型对照组小鼠肝组织中SOD、CAT、GSH含量明显降低，MDA含量明显升高(P<0.01)，表明小鼠衰老模型建立成功。与模型对照组比较，GA组、PA组、GPA组SOD、CAT(PA组除外)、GSH含量显著升高(P<0.05,P<0.01)，MDA含量显著降低(P<0.05，P<0.01)。见表2。

2.3GA、PA、GPA对D-半乳糖致衰老小鼠脑组织SOD、CAT 、GSH和MDA含量的影响 与正常对照组比较，模型对照组小鼠脑组织中SOD、CAT、GSH含量明显降低，MDA含量明显升高(P<0.01)，表明小鼠衰老模型建立成功。与模型对照组比较，GA组GPA组CAT 、GSH、SOD含量显著升高(P<0.05，P<0.01)，MDA含量显著降低(P<0.01)。PA组GSH含量显著升高(P<0.05)，MDA含量显著降低(P<0.01)。见表3。

表2 GA、PA、GPA对D-半乳糖致衰老小鼠肝脏SOD、CAT、GSH和MDA含量的影响

表3 GA、PA、GPA对D-半乳糖致衰老小鼠脑组织SOD、CAT、GSH和MDA含量的影响

2.4GA、PA、GPA对D-半乳糖致衰老小鼠肝组织结构的影响 正常对照组肝脏组织结构正常，肝细胞相互连接形成肝板，以中央动脉为中心向周围呈辐射状形成肝小叶，肝细胞之间空隙形成肝血窦，细胞质丰富，细胞核较大，核仁明显，无炎性细胞浸润。模型对照组肝细胞内炎性细胞较多，胞质疏松，细胞界限模糊，肝血窦不明显，染色质固缩；GA、PA组肝脏组织结构正常，着色清晰，肝板排列不整齐，炎性细胞浸润减轻，染色质固缩现象缓解；GPA组肝脏组织结构正常，着色清晰，肝血窦明显，结构完整，细胞界限明显，胞核胞质未发现异常，形态结构较好。见图1。

2.5GA、PA、GPA对D-半乳糖致衰老小鼠组脑织结构的影响 正常对照组大脑组织结构正常，大脑皮层分子层、锥体细胞层分层较明显；与正常对照组相比较，模型对照组细胞分层不明显，锥体细胞数量较少，散落分布；GA、PA、GPA组大脑细胞分层明显，锥体细胞明显增多。见图2。

箭头表示炎性细胞图1 各组肝组织切片(HE，×200)

1.大脑分子层；2.锥体细胞层；箭头表示锥体细胞图2 各组脑组织切片(HE，×200)

3 讨 论

1985年，D-半乳糖衰老模型由徐黻本教授提出，D-半乳糖致衰老的过程与机体的自然衰老过程较为相似，因此已被广泛应用于抗氧剂、抗衰老药物等的筛选〔7，8〕。D-半乳糖进入体内引起的氧自由基代谢失衡是诱发衰老的主要原因。过量D-半乳糖会使机体和细胞内半乳糖醇积累，导致细胞肿胀、功能障碍、代谢紊乱，体内活性氧水平升高，细胞脂质受损，以致机体多器官、多系统的功能减退，最终导致衰老的发生〔9〕。

董会萍〔10〕研究发现最佳D-半乳糖小鼠衰老模型的剂量范围为120～150 mg/(kg·d)，颈部皮下注射与腹腔注射无明显差异。故本实验采用腹腔注射D-半乳糖致衰老模型，给药剂量为150 mg/(kg·d)。徐辉等〔11〕研究发现衰老模型组肝细胞排列紊乱，肝细胞广泛脂肪样变性，胞质明显疏松、肿胀，并可见点状及灶性坏死。正常组肝细胞排列整齐，肝细胞呈多边形，细胞质丰富，细胞核较大，核仁明显，染色质稍疏松，汇管区无炎性细胞浸润。所以肝组织结构变化常作为肝脏损伤的考察指标。衰老小鼠在学习记忆功能上可明显减退，这种改变与其记忆相关脑区大脑皮层、海马等突触界面形态结构的衰老性变化有关，也常用做筛选具有抗衰老的药物〔12，13〕。

D-半乳糖衰老模型生化指标一般主要有SOD、CAT、GSH和MDA。GSH 是体内重要的抗氧化剂和自由基清除剂之一，能有效缓解机体内的氧化损伤，其含量可以衡量机体抗氧化能力的重要指标，MDA是机体内的自由基引发脂质过氧化的一种产物，常用来评价衰老程度。SOD是体内一种重要的抗氧化酶，能够有效清除超氧阴离子自由基，产生过氧化氢，CAT可分解过氧化氢，与SOD可协同彻底清除超氧离子，降低MDA及自由基代谢产物的产生，使细胞免受破坏〔14～17〕。

本研究表明，人参、鹿茸及其二者配伍后均能不同程度升高D-半乳糖致衰老模型小鼠血清、肝脏和脑组织中SOD、 CAT、GSH水平，降低MDA水平。相同给药剂量条件下，GA抗氧化活性优于PA抗氧化活性，GPA后抗氧化活性明显增加，二者具有协同作用。其机制可能与其提高机体的抗氧化能力有关，本研究结果可为进一步开发和利用人参鹿茸资源提供参考。