合作猪IFN-ε基因克隆及生物信息学分析

杨姣姣，谢开会，王 伟，闫尊强 ，杨巧丽，马艳萍，滚双宝，

(1.甘肃农业大学 动物科学技术学院，兰州 730070； 2.甘肃农业大学 图书馆，兰州 730070； 3.甘肃省现代养猪工程技术研究中心，兰州 730070)

干扰素(Interferon，IFN)是由瑞士研究人员Jean-Lindenmann和英国病毒生物学家Alick Isaacs在1957年利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感病毒干扰现象时，发现的一种具有多种生物活性的糖蛋白[1]。依据结构和来源的不同，IFN可分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型[2]，不同类型的干扰素具有相似的功能，如抗病毒、调控细胞分裂与增殖及介导机体免疫反应等[3]。IFN-ε是Ⅰ型干扰素重要成员之一，与IFN-α、IFN-β、IFN-ω、IFN-κ、IFN-δ、IFN-ν等具有相同的基因座位点、受体类型及相似的蛋白结构[4-6]。与其他Ⅰ型干扰素不同，IFN-ε表达于多种细胞，如冠状动脉平滑肌细胞、微血管内皮细胞和支气管上皮细胞[7]；此外，IFN-ε也具有抵抗病毒的活性[8]，在胎生哺乳动物早期胎盘发育过程中有重要保护作用[9-11]，研究还发现IFN-ε能保护女性生殖系统免受病毒和细菌的感染[9]。Fischer等[12]发现，IFN-ε在马子宫内膜组成性表达，是子宫内膜固有免疫系统的一部分，能防止病毒感染子宫。Demers等[13]发现，IFN-ε可能是抵抗粘膜病原体入侵的第一道防线。研究报道，IFN-ε已被证明可以预防人上皮细胞和T细胞感染艾滋病毒(HIV)[14]。Yang等[15]发现，重组犬IFN-ε与犬恶性肿瘤细胞A72共孵育时，有50%的肿瘤细胞生长受到抑制。目前，干扰素制剂作为一种新型生物制剂，在疾病预防和控制方面发挥着重要功能。合作猪是世界上少有的珍稀高原型猪种，甘肃合作为中心产区，地理隔离及独特的高原气候，使合作猪保存了独特的遗传结构和遗传性状[16]。作为小型原始地方品种，合作猪具有体型矮小、适应性和抗病性强等特点，是开展相关疾病研究的理想实验动物模型，具有广阔的应用前景[17]。近年来，人们对IFN-ε研究日益增加，Hardy等[4]发现，小鼠IFN-ε长度为664bp，编码192个氨基酸；人IFN-ε长度为642bp，编码208个氨基酸。王庭柱等[18]发现，牛IFN-ε编码193个氨基酸，牛IFN-ε蛋白具有典型的Ⅰ型干扰分子特征。犬IFN-ε基因编码208个氨基酸，其编码蛋白N端前21个氨基酸残基为信号肽[15]。有关猪IFN-ε的研究也有报道，如研究人员利用大白和长白二元杂交猪胃组织，成功克隆得到其IFN-ε基因序列[19]。然而迄今为止，鲜有合作猪IFN-ε基因克隆及生物信息学分析的报道。因此，本试验对合作猪IFN-ε进行克隆及生物信息学分析，以期为进一步研究合作猪IFN-ε生物学功能提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 样品 取健康合作猪(甘肃省甘南藏族自治州合作市)耳组织，液氮速冻后于-80 ℃保存，备用。

1.1.2 主要试剂 Trizol购自Invitrogen(美国)。pMD19-T Vector(6013)、反转录试剂盒(6210A)均购自宝生物工程 (大连) 有限公司。 2×TaqMaster Mix(KT211-01)，DH5α感受态细胞(CB101-02)，胶回收试剂盒(DP209-02)，一次性培养皿均购自天根生化科技(北京)有限公司。琼脂粉，氨苄青霉素，酵母提取物，胰蛋白胨购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 合作猪IFN-ε基因引物设计与合成 下载GenBank中猪IFN-ε基因序列(登录号为NM_001105310.1)，利用Premier 5.0软件设计引物，预期扩增长度为586 bp，包含582 bp的编码区，引物序列IFN-ε-F:5′- CACCATGATCAACAAGTCTTTC-3′和IFN-ε-R:5′-TCAAGGTTCCATTCCTTGTTT-3′，引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2.2 合作猪RNA提取与cDNA合成 用Trizol提取合作猪耳组织总RNA。用微量紫外可见分光光度计(NanoDrop 2000)测定RNA浓度和纯度，用反转录试剂盒对总RNA进行反转录，反转录体系10 μL：RNA 0.8 μL，Oligo dt Primer 1 μL，dNTP Mixture 1 μL，RNase-Free Water 7.2 μL。将10 μL反转录体系于65 ℃的水浴作用5 min，取出置于0 ℃的冰上，再加入如下体系：5× Prime Script Ⅱ Buffer 4 μL，RNase Inhibitor 0.5 μL，Prime Script Ⅱ RTase 1 μL，RNase-Free H2O 4.5 μL。将上述总体系20 μL的溶液置于48 ℃金属浴中，反应 1 h，95 ℃灭活5 min即可得到cDNA，-20 ℃保存，待用。

1.2.3 合作猪IFN-ε基因PCR扩增 反应体系(总体积为20 μL)：上、下游引物各0.5 μL，2×TaqMaster Mix 10 μL，cDNA模板2 μL，RNase-Free H2O 7 μL。反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测正确后，按照天根DP209-02凝胶回收试剂盒的操作说明书，对目的片段进行回收纯化。

1.2.4 合作猪IFN-ε基因克隆与测序 将PCR扩增产物回收纯化后，通过TA克隆方法将该序列在16 ℃连接至pMD19-T载体，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂板于LB固体培养基中，37 ℃恒温培养箱中培养12 h，进行蓝白斑筛选，用PCR法进行菌落鉴定，选取阳性菌液送苏州金唯智生物科技有限公司进行测序。

1.2.5 合作猪IFN-ε基因序列生物信息学分析 利用DNAMAN和Mega 5.0进行同源性比对和系统进化树构建；通过在线软件Protaram(https://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白质基本理化性质；通过在线软件TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)预测蛋白质跨膜结构；通过在线软件SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测蛋白信号肽；通过在线软件ExPASy服务器中Protscale(https://web.expasy.org/protscale/)分析蛋白质的亲疏水性；通过POSORT Ⅱ Prediction在线网站(https://psort.hgc.jp/form2.html)预测蛋白质的亚细胞定位；通过NCBI网站的CDD在线工具预测基因编码蛋白保守结构域；通过在线软件Prabi服务器的SOPMA程序(https://npsa-prabi.ibcp.fr/)预测蛋白质二级结构；通过在线软件SWISS-MODEL(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl)预测蛋白质三级结构。

2 结果与分析

2.1 合作猪IFN-ε基因克隆

以合作猪耳组织cDNA为模板，PCR扩增IFN-ε基因CDS区域，产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，发现1条长约586 bp的条带(图1)，与预期片段大小一致，说明成功获得合作猪IFN-ε基因CDS区域。

M.2000 DNA marker；1.IFN-ε基因PCR扩增产物 PCR product ofIFN-εgene；2.阴性对照 Negative control

图1 合作猪IFN-ε基因PCR扩增产物
Fig.1 PCR amplification product ofIFN-εgene in Hezuo pig

2.2 合作猪IFN-ε基因序列测序及分析

测序结果显示，合作猪IFN-ε基因CDS区长582 bp，编码193个氨基酸(图2)。同源性比对结果发现，合作猪IFN-ε基因编码序列与杜洛克猪(Duroc，NM_001105310.1)、小鼠(Musmusculus，NM_177348.2)、人(Homosapiens，NM_176891.4)、黑猩猩(Pantroglodytes，XM_528573.4)、犬(Canislupusfamiliaris，XM_022425479.1)、瘤牛(Bosindicus，XM_019965656.1)、蒙古野马(Equusprzewalski，XM_008531931.1)、山羊(Caprahircus，XM_013965868.2)和绵羊(Ovisaries，XM_012127127.2)的序列同源性分别为98.4%、 56.8%、77.7%、78.2%、76.5%、87.0%、85.5%、 85.0%和86.0%(表1)。采用MEGA5.0中的N-J方法构建物种系统进化树，发现合作猪与杜洛克猪的亲缘关系最近，与瘤牛、蒙古野马、绵羊、山羊亲缘关系较近，与小鼠亲缘关系最远(图3)。

图2 合作猪IFN-ε基因CDS区和编码氨基酸序列Fig.2 Nucleotide sequence and amino sequence of IFN-ε gene CDS region in Hezuo pig

2.3 合作猪与杜洛克猪IFN-ε基因CDS序列和氨基酸序列比对

合作猪与猪参考基因组IFN-ε基因(登录号：NM_001105310.1)CDS序列比对结果表明，合作猪IFN-ε基因CDS序列存在3个碱基突变，均为错义突变，86 bp处C突变为T导致第29位丝氨酸突变为苯丙氨酸，199 bp处A突变为G导致第67位甲硫氨酸突变为缬氨酸，406 bp处T突变为G导致第136位半胱氨酸突变为甘氨酸(图4)。

2.4 合作猪IFN-ε蛋白理化性质分析

ProtParam在线服务器分析结果显示，合作猪IFN-ε蛋白由193个氨基酸残基组成(表2)，分子式为C1027H1630N278O290S10，分子质量为 22.83 ku，理论等电点为8.43，说明该蛋白为碱性蛋白。肽链N端为蛋氨酸(Met)，在体外的理论半衰期为30 h，不稳定系数为47.17，属于不稳定蛋白。脂肪系数为99.48，平均亲水系数为 -0.240，属于亲水蛋白。

表1 IFN-ε基因CDS同源性比较Table 1 Comparison of CDS homology of IFN-ε gene %

图3 IFN-ε基因系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of IFN-ε gene

图4 合作猪与杜洛克猪IFN-ε基因编码氨基酸序列比对结果Fig.4 Sequence comparison result of IFN-ε gene amino acid between Hezuo pig and Duroc

表2 合作猪IFN-ε蛋白氨基酸组成
Table 2 Composition of amino acids inIFN-εprotein of Hezuo pig

氨基酸Amino acids数量Number频率/%Frequency氨基酸Amino acids数量Number频率/%FrequencyAla(A)73.6Lys(K)115.7Arg(R)115.7Met(M)73.6Asn(N)84.1Phe(F)126.2Asp(D)42.1Pro(P)42.1Cys(C)31.6Ser(S)168.3Gln(Q)2110.9Thr(T)63.1Glu(E)168.3Trp(W)21Gly(G)52.6Tyr(Y)52.6His(H)52.6Val(V)105.2Ile(I)94.7Pyl(O)00Leu(L)3116.1Sec(U)00

2.5 合作猪IFN-ε蛋白疏水性分析

运用ExPASy服务器中ProtScale程序对合作猪IFN-ε蛋白做疏水性分析发现，其中第10位甲硫氨酸(Met)疏水性最强(分值为2.678)，第72位酪氨酸(Tyr)疏水性最弱(分值为-3.056)，在负值区域有较多氨基酸(图5)，这与Protaram预测结果一致。

2.6 合作猪IFN-ε蛋白二级结构和三级结构预测分析

合作猪IFN-ε蛋白二级结构预测表明，此蛋白中α-螺旋占61.66%，无规则卷曲占30.05%，β-转角占3.11%，延伸链占5.18%(图6)。通过SWISS-MODEL平台对合作猪IFN-ε蛋白建模预测三级结构发现，IFN-ε蛋白以α-螺旋和无规卷曲为主(图7)。

图5 合作猪IFN-ε蛋白的疏水性预测结果Fig.5 Prediction of hydrophobicity of IFN-ε protein in Hezuo pig

h.α-螺旋 Stands for alpha-helix；e.延伸链 Epresents extended chain；c.无规则卷曲 Stands for irregular curling；t.β-转角 Trefers to beta-angle of rotation

图6 合作猪IFN-ε蛋白二级结构预测
Fig.6 Secondary structure of IFN-ε protein in Hezuo pig

图7 合作猪IFN-ε蛋白三级结构预测Fig.7 Tertiary structureof IFN-ε protein in Hezuo pig

2.7 合作猪IFN-ε蛋白跨膜结构预测及信号肽分析

运用TMHMM对合作猪IFN-ε蛋白跨膜结构进行分析，预测结果表明IFN-ε蛋白不存在跨膜结构(图8)。使用SignalP 4.1软件预测蛋白信号肽发现，合作猪IFN-ε蛋白具有信号肽，综合考虑S值、C值、Y值的得分发现，其信号肽位于第1至第21位氨基酸残基之间(图9)，说明该蛋白为分泌型蛋白。

2.8 合作猪IFN-ε蛋白的亚细胞定位分析

运用PSORT中k-NN计算程序预测合作猪IFN-ε蛋白亚细胞分布可能情况为：细胞质(cytoplasmic)11.1%、细胞核(nuclear)11.1%、线粒体(mitochondrial)11.1%、质膜(plasma membrane)22.2%、细胞外(extracellular,including cell wall)33.3%、液泡(vacuolar)11.1%，说明IFN-ε蛋白主要分布于细胞外。

图8 合作猪IFN-ε蛋白跨膜结构Fig.8 Transmembrane structure of IFN-ε protein in Hezuo pig

图9 合作猪IFN-ε蛋白信号肽预测Fig.9 Predicted result of IFN-ε protein signal peptide in Hezuo pig

2.9 合作猪IFN-ε蛋白的保守结构域预测

运用NCBI的CDD在线工具来预测合作猪IFN-ε蛋白保守结构域。结果显示，合作猪IFN-ε蛋白只含有1个超家族保守结构域，即IFab超家族，位于29～186位氨基酸残基(图10)。

图10 合作猪IFN-ε蛋白保守结构域预测Fig.10 Conserved domain prediction of IFN-ε protein in Hezuo pig

3 讨 论

干扰素目前被确认为机体防御广谱的病毒性疾病的第一道防线[20-22]，而Ⅰ型干扰素是先天性免疫和适应性免疫的核心[23]。Ⅰ型干扰素 IFN-α己经被广泛应用于临床治疗，但神经抑郁是其普遍的副作用[24]；人IFN-ε具有部分IFN-α的功能，还具有维护脑神经正常等功能，有望成为IFN-α不良反应严重患者的替代药品[25]；此外，IFN-ε在胎生哺乳动物早期胎盘发育过程中有重要作用[9-11]。近年来，人、鼠、犬、牛等物种IFN-ε相继被成功克隆[4,15,18]。本试验克隆获得合作猪IFN-ε基因的完整编码序列，全长582 bp，编码193个氨基酸，与台玉磊等人研究结果一致[19]。核苷酸序列对比结果发现，合作猪IFN-ε基因编码序列与杜洛克猪IFN-ε基因编码序列同源性高达98.4%，与羊、牛等哺乳动物同源性达到80%以上，而与小鼠的同源性仅为56.8%，这说明在近缘物种间IFN-ε具有较高的保守性；系统进化树结果也表明，合作猪与杜洛克猪的遗传距离最近，与小鼠遗传距离最远，进一步说明干扰素具有相对种属特异性。研究报道，大白长白二元杂交猪IFN-ε基因与小鼠IFN-ε基因同源性较差，符合物种间的亲缘关系[19]，与本研究结果类似。基因编码区碱基突变，可能引起基因编码蛋白序列、结构和功能发生变化[25]。李莉莉等[26]发现，IFN-ε 155位半胱氨酸突变成丝氨酸后，重组人干扰素突变样品回收率明显高于未突变样品，但氨基酸突变后对重组人干扰素抗病毒活性没有明显影响。与杜洛克猪相比，合作猪IFN-ε基因CDS序列存在3个碱基突变，从而引起3个氨基酸突变，说明合作猪与杜洛克猪IFN-ε基因可能存在某些生物功能上的差异，这些差异是否影响猪的抗病性强弱还需今后进行深入研究分析。

合作猪IFN-ε蛋白不存在跨膜结构，说明其不是跨膜蛋白，但存在信号肽序列，表明该蛋白是分泌型蛋白，能在细胞外起作用，这与亚细胞定位预测结果一致。研究报道，人[7]，犬[15]，牛[18]，大白长白二元杂交猪[19]IFN-ε蛋白均存在信号肽序列，且它们的蛋白编码序列N端前21个氨基酸为信号肽，与本研究结果一致。研究发现，一般情况下，新生蛋白通常在位于其N端的信号肽的指引下到达细胞特定区域，并由其介导进行跨膜转运[27]，干扰素产生后必须与细胞膜上的特异性受体结合才能发挥其功能[28]，合作猪IFN-ε蛋白信号肽的存在，对保证其发挥正常功能有重要意义。蛋白质半衰期与其稳定性之间存在密切联系，一般来说，半衰期长则蛋白质稳定性高[29]。有研究报道，蛋白质N端氨基酸序列与蛋白质稳定性具有很强的相关性，有近80%的短寿命蛋白含有信号肽[30]。本研究结果显示，IFN-ε蛋白具有较长的半衰期，却属于不稳定蛋白，这可能与合作猪IFN-ε蛋白存在信号肽有关。相对于IFN-ε蛋白中间氨基酸序列来说，其两端的氨基酸序列保守性较差，进一步分析发现，其中间氨基酸序列有一个保守结构域IFab。IFab结构域属于较大螺旋细胞因子超家族，包括生长激素、白细胞介素、若干集落刺激因子和若干其他调节分子，通过与细胞表面受体相互作用调节细胞活性，激活各种信号通路，能够参与抗病毒和抗增殖反应[31]。IFN通过与细胞表面受体IFNAR1和IFNAR2结合发挥其生物活性。IFN-IFNAR相互作用激活JAK1和TYK2激酶以及转录因子STAT1和STAT2[32-33]。Janus激酶/信号转导与转录激活子(The Janus kinase/signal transducer and activator of transcriptions ,JAK/STAT)信号通路和其他激酶和转录因子最终诱导IFN基因表达，保护机体免受病毒、细菌甚至真菌的感染[9,34-36]。Yang等[15]研究表明，犬IFN-ε能激活JAK/STAT信号通路，诱导干扰素诱导基因(ISGs)表达，发挥抗病毒作用[37]。本试验结果为进一步研究该基因的结构和功能提供了理论依据。

4 结 论

本试验克隆得到合作猪IFN-ε基因CDS序列，全长582bp。生物信息学分析表明，合作猪IFN-ε编码193个氨基酸，CDS序列存在3个突变，均为错义突变，其与瘤牛、蒙古野马、绵羊、山羊等物种同源性较高。IFN-ε蛋白为碱性、亲水、不稳定型蛋白，二、三级结构预测显示，该蛋白主要以α-螺旋和无规卷曲为主。