茶树己糖激酶基因CsHXK1的克隆与表达分析

陈江飞，杨建坤，黄慧宇，余有本，王伟东

(西北农林科技大学 园艺学院，陕西杨凌 712100)

茶树[Camelliasinensis(L.)O.Kuntze]作为一种叶用经济作物，在中国乃至世界范围具有广泛的栽培种植。然而，茶树在其生长发育过程中经常面临着各种环境胁迫的影响，如冬季和早春的低温胁迫、夏季的高温和干旱胁迫，以及土壤盐渍化引起的高盐胁迫等。因此，明确茶树胁迫响应机制，筛选和鉴定抗性基因对培育抗性茶树优良品种具有重要意义。

众所周知，己糖(六碳糖，如葡萄糖和果糖)是植物中大多数代谢途径和有机物质合成的原始底物，其在参与糖酵解、呼吸作用、物质合成和分解代谢前需进行磷酸化，而己糖激酶(Hexokinase，HXK)是催化己糖磷酸化的关键酶之一[1]。目前，越来越多的研究证实HKX不仅具有催化己糖磷酸化的作用，其还参与植物糖感受和糖信号转导过程[2]。例如，拟南芥AtHXK1和AtHXK2反义转基因植株对外源葡萄糖的敏感性显著降低，而过表达转基因植株对外源葡萄糖高度敏感[3]；进一步的研究表明，拟南芥AtHXK1通过感知葡萄糖水平，从而参与细胞增殖、根和花序生长、叶片膨胀和衰老以及叶片蒸腾等植物生长发育过程[4-6]。另外，植物HXK可以把叶绿体生成的糖信号传导到细胞核中，调节光合作用有关基因的表达，进而调控植物的光合作用，同时己糖激酶在质体-细胞核的信号传导中也有着至关重要的用途[7]。此外，许多研究证实HXK参与了植物对各种生物和非生物胁迫的响应过程。例如，NbHXK1、 AtHXK1和AtHXK2参与了甲基紫精和病原体感染诱导的氧化应激[8]；低温、渗透和盐胁迫能够显著诱导拟南芥AtHXK2的表达，而抑制情况AtHXK3的表达[9-10]；过表达的水稻OsHXK5或OsHXK6能够显著抑制植株生长，其可能依赖于对光合基因RBCS的抑制作用[11]；类似地，AtHXK1在保卫细胞中的过表达促进了气孔的关闭，进而降低了糖处理下植株的蒸腾作用[6]；HXK1通过氧化磷酸化调控水稻OsCIPK15基因的表达参与缺氧信号途径[12]。然而，茶树中有关NXK的研究相对滞后，其参与茶树胁迫响应的功能机制尚不清楚。

本试验从茶树中克隆获得了CsHXK1基因cDNA序列，利用生物信息学技术分析了该基因及其编码蛋白的结构特征，并利用实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)分析了CsHXK1在高温、干旱、低温及盐胁迫下的表达模式，以期为探讨该基因逆境胁迫下的生物学功能奠定基础，为茶树抗逆分子遗传育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料及处理

以长势一致的‘龙井长叶’品种茶树穴盘扦插苗为试验材料，于人工气候箱中进行预培养。2周后，分别对茶苗进行高温(40 ℃)、低温(4 ℃)、盐胁迫(200 mmol/L NaCl)和干旱胁迫(20% PEG 6000)处理，其他条件保持不变。每个处理设置3次重复，并于处理后0、2、6、12、24和48 h分别取0.1 g嫩叶；此外，取未处理茶苗的根、嫩茎、嫩叶以及花器官用于组织表达分析，所有样品用液氮速冻并置于-80 ℃保存，备用。

1.2 茶树总RNA提取和cDNA合成

茶树叶片材料的总RNA采用CTAB法进行提取，用NanoDrop 2000c(Thermo Scientific，美国)对RNA的浓度和质量进行检测，再经质量分数为1%变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。利用反转录试剂盒(ABM，加拿大)合成cDNA用于基因的克隆及荧光定量PCR反应。

1.3 茶树 CsHXK1基因的克隆

根据茶树基因组[13]中CsHXK1基因序列设计特异性全长引物(F：GAATCGATCTCTGAGCCTGTGATGG，R：CTGAATACTTGGCCTTTGACCAT)，以‘龙井长叶’品种茶树cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应程序为：94 ℃ 预变性5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，32 个循环；72 ℃ 延伸10 min。PCR产物经质量分数为1.25%琼脂糖凝胶电泳检测并回收目的条带，回收产物连接至pMD19-T 载体(TaKaRa，大连)进行测序。

1.4 生物信息学分析

利用ProtParam tool在线软件(https://web.expasy.org/protparam/)预测蛋白理化性质；ProtScale(http：//web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl)进行亲/疏水性分析；Netphos 3.0 Serve(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos)预测蛋白质磷酸化位点；用软件DNAMAN8 进行多序列比对，用MEGA 6.0构建系统进化树；用在线软件WoLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)预测蛋白亚细胞定位，采用SignaIP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在线软件进行信号肽预测。

1.5 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析

根据基因序列设计定量引物(F：CAGAATATGATCAAGCATTGGAT，R：TATGAGGGGTCCTTAAAATAAATGG)，以茶树CsPTB基因为内参基因(F：TGACCAAGCACACTCCACACTATCG，R：TGCCCCCTTATCATCATCCACAA)，参照SYBR○RPremix ExTaqⅡ(TaKaRa，大连)试剂盒说明进行qRT-PCR分析，反应程序为：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min 30 s，循环 40次；60 ℃ 30 s，71 个循环，每次上升0.5 ℃。每个样品设3次技术重复，数据采用2-ΔΔCT算法分析[14]。

1.6 数据处理

利用Excel 2010和SPSS 22软件对试验数据进行处理和统计分析。

2 结果与分析

2.1 茶树 CsHXK1基因的克隆

以茶树‘龙井长叶’叶片的cDNA为模板，通过RT-PCR扩增获得特异性单一条带(图1)，测序结果显示该条带序列全长1 534 bp，包含一个1 488 bp的开放阅读框，编码495个氨基酸，与茶树基因组中序列一致为茶树CsHXK1基因cDNA序列。此外，基因结构分析结果显示茶树CsHXK1基因由9个外显子和8个内含子组成(图2)。

M. DL2000; 1-2：PCR产物 PCR amplification product

图1 茶树CsHXK1基因cDNA全长序列RT-PCR扩增
Fig.1 RT-PCR amplification of the full-length cDNAofCsHXK1gene in tea plant

2.2 茶树CsHXK1蛋白多序列比对与进化分析

多序列比对结果显示，茶树CsHXK1蛋白与其他物种的HXK1蛋白具有较高的相似性，且均包含2个磷酸化作用位点：phosphate 1和phosphate 2、一个底物结合位点sugar binding和一个ATP结合位点(图3)。进化分析显示，茶树CsHXK1蛋白与拟南芥AtHXK1、苹果MdHXK1和甘蓝BoHXK1的进化关系较近，而与单子叶植物水稻的亲缘关系较远(图4)。

图2 茶树 CsHXK1基因的结构分析Fig.2 Structural analysis of CsHXK1 gene in tea plant

2.3 茶树CsHXK1蛋白生物信息学分析

2.3.1 茶树CsHXK1蛋白理化性质分析 蛋白理化性质预测显示，茶树CsHXK1蛋白分子式为C2379H3816N652O709S23，其蛋白分子质量为53.63 ku，理论等电点为5.96，含有负电荷残基(Asp+Glu)62个，正电荷残基(Arg+Lys)54个。疏水性分析结果显示CsHXK1蛋白的亲水区域大于疏水区域，且GRAVY指数为-0.002，表明其属于亲水性蛋白(图5)。

实线框为磷酸化位点 The solid line frame is the phosphorylation site；虚线框为ATP结合位点 The dotted line frame is the ATP binding site；下划线为底物结合位点 The underline is the substrate binding site

图3 茶树与其他植物HXK1蛋白的多序列比对
Fig.3 Multiple sequence alignment of HXK1 from tea plant and other plants

2.3.2 茶树CsHXK1蛋白磷酸化分析 磷酸化位点预测分析显示，CsHXK1蛋白包含多个磷酸化位点，其中以丝氨酸位点居多，推测其可能受到磷酸化的调控作用(图6)。亚细胞定位预测结果显示CsHXK1蛋白主要定位与叶绿体和细胞核中；此外，SignalP软件预测显示在CsHXK蛋白的第54～55位氨基酸处存在信号肽。

图4 不同物种的HXK1蛋白进化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of HXK1 protein sequences from different species

图5 茶树CsHXK1蛋白疏水性分析Fig.5 Hydrophobicity analysis of CsHXK1 protein

图6 茶树CsHXK1蛋白磷酸化位点分析Fig.6 Analysis of phosphorylation site of CsHXK1 protein

2.4 茶树 CsHXK1基因启动子顺式作用元件 分析

利用PLACE软件对CsHXK1基因上游启动子区域的顺式作用元件进行预测，结果发现CsHXK1基因启动子区域含有与逆境胁迫响应相关的元件，如脱落酸响应元件ABRE、机械损伤响应元件Wun-motif、脱水响应元件ACGTATERD1和低温响应元件MYBCORE等，还包含多个与激素信号转导和糖信号转运等相关的顺式作用元件，如TGACG-motif和MYCCONSENSUSAT等 (表1)。

2.5 茶树 CsHXK1在不同组织中的表达分析

如图7所示，CsHXK1基因在各个组织中都能被检测，且呈现出一定的组织表达特异性，其在茶树的花器官中表达量最高，其次是叶片，根和茎中最低。

2.6 非生物胁迫下茶树 CsHXK1基因表达模式分析

qRT-PCR结果显示，在不同胁迫处理下茶树CsHXK1基因均被诱导表达，但其表达趋势存在明显差异(图8)。其中，CsHXK1的表达水平在高温处理的前12 h快速升高，且在第12 h达到峰值，约为对照的10倍左右，之后其表达量急速回落到对照水平；而20% PEG 6000模拟干旱处理下，CsHXK1基因表达水平逐步上升，在第 48 h达到对照的6～7倍，但在12 h时有轻微的降低；在低温处理下，CsHXK1在第2 h受诱导上调表达，并在第12 h达到表达峰值，后期逐渐回落；CsHXK1在盐处理下一直维持较高的表达水平。

表1 茶树 CsHXK1基因启动子区域重要顺式作用元件分析Table 1 Analysis of important cis-acting regulatory elements in the upstream regulatory sequence of CsHXK1

图7 茶树 CsHXK1基因在不同 组织中的表达分析Fig.7 Analysis of expression of CsHXK1 gene in different tissues

3 讨 论

HXK蛋白不仅能够催化己糖磷酸化，为植物的生命活动提供能量保证，而且在糖信号转导以及逆境响应方面也具有重要的生物学功能。目前，有关于HXK蛋白的研究已经成为广泛关注的热点[15-16]。

目前，拟南芥中鉴定有6个HXK成员，其中AtHXK1.2、AtHXK1.3、AtHXL1和AtHXL2基因包含9个外显子和8个内含子[2]；Cho等[17]发现除了水稻OsHXK1之外，绝大多数的OsHXK含有相同数量的外显子和内含子。同时， Guo等[18]证实基因的内含子数目与长度对基因的表达具有重要影响。本研究中笔者也发现茶树CsHXK1基因由9个外显子和8个内含子组成，这与小立碗藓[19]和苹果[20]HXK的研究结果一致，表明单、双子叶植物的HXK1基因的结构均高度保守，推测其发挥着类似的生物学功能。另外，信号肽预测显示茶树CsHXK1蛋白在N端具有信号肽，这暗示CsHXK1可能是分泌性蛋白，其在信号肽的作用下，运输到指点地点后对其目标底物进行磷酸化作用[20]。前人的研究指出，植物HXK蛋白在细胞中的定位具有明显的不同，如拟南芥AtHXL2和AtHXL3定位于线粒体膜上[2]，烟草HXK蛋白则定位于叶绿体[21]，还有一些单子叶植物如水稻玉米的HXK蛋白定位于细胞质内[21]，且不同的亚细胞定位也导致其功能上的差异[22]。笔者预测发现茶树CsHXK1蛋白主要定位于叶绿体和细胞核中，结合Cho等[11]研究认为细胞核内的HXK蛋白能够与VHA-B1和RPT5B结合成复合体，并作用于葡萄糖信号调节基因的启动子，以此调控目的基因的表达；而定位于叶绿体中的HXK在功能上主要是对叶绿体中的己糖进行磷酸化[19，23]，推测茶树CsHXK1蛋白可能在叶绿体和细胞核中也具有相类似的功能，然而这需要进一步试验验证。

图8 茶树 CsHXK1基因的表达模式分析Fig.8 Analysis of expression pattern of CsHXK1 gene in tea plant

许多研究表明，HXK基因在植物不同组织间的表达水平有较大差异，对植物的生长发育起到不同的调控作用[2，17]。例如，甘薯IbHXK1在成熟的块茎中表达较高，参与对淀粉的酵解过程[24]；水稻多数HXK在水稻的未成熟的种子、茎、叶片、花中均有表达，而OsHXK10仅在花中被检测到[2]；苹果MdHXK1则主要在花中表达，并与花瓣中花青素的积累密切相关[20]。本研究发现茶树CsHXK1也在叶片和花中有较高的表达，表明其可能在上述组织器官中发挥重要作用。此外，大量研究已证实HXK广泛参与植物非生物胁迫响应过程，例如过表达拟南芥AtHXK1和AtHXK2能够明显增强转基因植株对氧化胁迫的耐受性[8]；拟南芥AtHXK2受到干旱、盐和低温的显著诱导，而高温、干旱等逆境也会提升AtHXKL3的转录水平[9]；在水稻和向日葵中，一些HXK的同源基因也不同程度的受非生物胁迫的诱导[25-26]。最近，赵锦等[20]发现苹果MdHXK1除了受到盐、低温及外源ABA的显著诱导，还发现其启动子区域包含多个与逆境响应的相关元件。本研究亦发现茶树CsHXK1基因启动子区域含有多个逆境响应元件，如ABA响应元件、脱水响应元件及低温响应元件，这可能与其响应逆境胁迫具有密切的联系。同时，qRT-PCR结果也表明茶树CsHXK1受到高温、干旱、低温及盐胁迫的显著诱导，这与Li等[27]的结果高度一致，意味着CsHXK1参与到多种非生物胁迫响应过程中。本研究为进一步探究茶树CsHXK1在非生物胁迫响应过程中的功能提供了重要的前期参考。