氯化汞对中国大鲵皮肤CATH-BF基因及心脏和胰腺CATH-2、CATH-3基因表达的影响

叶 婷，王兴香，刘亚男，曹 宇，许抗抗，李 灿

(贵阳学院 生物与环境工程学院/贵州省山地珍稀动物与经济昆虫重点实验室，贵州 贵阳 550005)

汞(Hg)是一种环境中广泛存在的有毒污染物，广泛应用于工业、家庭、农业和医疗等多种行业，对人类健康和环境的潜在影响已引起广泛担忧[1]。两栖动物有汞暴露和毒性的风险。汞含量在以附着生物为食的南方豹蛙(Lithobatessphenocephalus)蝌蚪的饮食中相对较高，但不具有高生物利用度[2]。美国青蛙(Lithobatesgrylio)腿组织中的总汞含量非常高[3]，在没有人为或地质汞的地方石斛蝌蚪膳食中总汞含量为50～1 600 ng/g (干质量)[4]。研究发现，汞污染场地两栖动物体内的汞含量超过参考汞含量1个数量级，某些情况下，两栖动物体内汞含量超过引起幼龄和成龄毒性反应的阈值[5]。最近的研究发现，汞对两栖动物种群的生存、生长和发育都有影响[6-7]。汞对青蛙(Xenopuslaevis)暴露后导致组织细胞谷胱甘肽水平降低并产生过多的活性氧，通过阻断或氧化其巯基基团降低硫转移酶活性，从而导致组织尤其是心脏和睾丸中的硫烷硫含量降低，进一步介导各种毒性效应[8]。汞在大鲵生存的水体环境中含量虽然较低，但可通过食物链逐渐富集，从而对大鲵产生毒害效应。在大鲵原生境水质中检测出汞含量低于10 ng/L，在大鲵肌肉中检测出汞含量为0.023 mg/kg[9-10]。目前还没有关于汞对大鲵生态毒理影响的报道。

抗菌肽(AMP)是先天免疫系统中机体抵御入侵微生物的一个关键组成部分[11]，在过去的几十年中，抗菌肽由于其广谱抗菌活性和降低细菌抗性而被认为是潜在的新型药剂[12]。CATH是结构多样的抗菌肽的主要家族，CATH在哺乳动物、爬行动物和鱼类等许多不同脊椎动物物种中被鉴定，据报道，CATH在免疫系统中发挥着重要作用[13-15]。截至目前，大量的CATH已被鉴定和研究，这些CATH具有一般特征，一般情况下，CATH被合成为前体，其具有1个N末端的信号肽、1个保守的抗菌结构域、1个不同序列和长度的C末端成熟抗菌结构域[16-17]。CATH显示出广谱抗菌、抗病毒和抗真菌活性[18-20]。除了具有直接抗菌作用外，CATH在宿主免疫系统不同阶段还具有其他调节作用，如抑制细胞凋亡、促进伤口愈合、降低脂多糖(LPS)引起的炎症毒性效应、刺激细胞因子、调节适应性免疫应答[21-24]。因此，CATH在免疫系统中发挥重要作用，可作为潜在的药物用于商业用途。多种脊椎动物的CATH已经被鉴定研究，但许多两栖动物物种的CATH还没有被鉴定研究。据报道数据，仅鉴定了5种两栖类CATH，包括牛蛙(Ranacatesbeiana)的CATH-RC1和CATH-RC2，绿点湍蛙(Amolopsloloensis)的CATH-AL，双团棘胸蛙(Paayunnanesis)的CATH-PY，以及脆皮大头蛙(Limnonectesfragilis)的CATH1和CATH2[16,25-27]。然而，在两栖类动物物种中大多数CATH都是从无尾类两栖动物中鉴定出来的，在有尾目两栖动物中发现较少。中国大鲵[Chinese giant salamander (Andriasdavidianus)]，属于有尾目两栖动物，是世界上现存最大的两栖动物物种[28]。与其他两栖动物一样，大鲵皮肤也含有丰富的生物活性肽如抗菌肽和抗氧化肽[29-31]。此外，近年来，大鲵正在成为中国重要的商业水产养殖品种，但是养殖水体中存在的一些污染物如汞可能对大鲵产生免疫毒性反应，破坏大鲵的免疫系统，进而降低大鲵对病原体的抵抗能力，从而使大鲵患上严重的疾病，一些严重的疾病经常影响到这个行业并带来巨大的经济损失[32]。因此，了解汞对大鲵免疫系统关键因子如抗菌肽和抗氧化肽分子的基因表达影响极其重要。

描述了来自大鲵的3个新型CATH同源物，它们在皮肤、胰腺和心脏有表达，而且CATH在大鲵心脏和胰腺中的表达还没有报道。在中国大鲵相关研究中，还没有从生态毒理学角度分析环境HgCl2诱导下CATH成员CATH-2、CATH-3和CATH-BF在皮肤、心脏和胰腺中的表达变化模式。为此，检测了经HgCl2处理后CATH相关基因在皮肤、心脏和胰腺中的表达变化模式，旨在为评价HgCl2对大鲵的生态毒理影响提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

将采自贵州省修文市大鲵养殖户的中国大鲵,置于大鲵人工养殖实验室温度为(19±1)℃的循环水养殖系统中进行养殖。换水时要将水温调节到与循环系统相同的水温。在日常养殖中，避免用具交叉使用，用具用完后要用水洗净。采集饲养在干净水槽中的幼龄大鲵[(250±25)g]，在标准试验条件下驯化2 d。

1.2 方法

1.2.1 HgCl2对大鲵的暴露试验 将驯化后的大鲵暴露于CK(0 ng/L HgCl2)、HgCl2(1、10、100 ng/L)中，每个处理设置3个重复，每个重复含有3尾大鲵，暴露液每天更换一次。分别处理24、48、72 h后，用液氮冻存从预先麻醉的大鲵中分离的皮肤、胰腺、心脏组织，用于组织RNA的提取和实时定量RT-PCR(qRT-PCR)检测。

1.2.2 总RNA的提取及cDNA 第一链的合成 取大鲵皮肤、心脏和胰腺组织加入液氮进行研磨，使用TRIzol (Invitrogen公园)提取试剂盒根据说明书提取大鲵各组织的总RNA，提取后的RNA经电泳检测完整性和核酸浓度仪检测纯度及浓度以保证提取RNA的质量，然后用DNA酶Ⅰ(Promega公司)去除基因组DNA，使用逆转录试剂盒(大连Takara公司)按照说明书将提取的总RNA反转录成cDNA。

1.2.3 qRT-PCR分析 采用qRT-PCR技术检测大鲵不同组织CATH基因的相对表达量。根据1.2.2中方法提取不同组织RNA并反转录成cDNA后进行实时定量PCR。用于荧光定量PCR的引物序列见表1。反应体系为20 μL：GoTaq®qPCR Master Mix 10 μL、cDNA模板1 μL、不含Nuclease水7 μL和上、下游引物各1 μL。反应在CFX96TM Real Time System 实时定量PCR仪 (Bio-Rad公司) 中进行，反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环；最后在60～95 ℃进行熔解曲线分析。选择表达相对稳定的TATA框结合蛋白基因(TATA-box-binding protein gene,TBP)作为内参基因，利用2-△△CT方法计算基因的相对表达量[33]。

表1 用于实时定量RT-PCR分析的引物Tab.1 Primers used in the real time quantitative RT-PCR analysis

1.3 数据统计

试验数据采用平均值±标准差表示，并进行方差齐性检验和正态性检验，如有必要需进行对数转换。采用SPSS 16.0软件进行单因素方差分析(One-Way AVONA)和Turkey’s检验。置信水平P<0.05时差异显著，置信水平P<0.01时差异极显著。

2 结果与分析

2.1 HgCl2对大鲵皮肤CATH-BF基因相对表达水平的影响

暴露 24、48、72 h后，HgCl2对大鲵皮肤CATH-BF基因相对表达水平的影响见图1。结果显示，HgCl2对大鲵暴露24 h后，大鲵皮肤CATH-BF基因表达水平相对于对照组均呈现下降变化趋势，即1、10、100 ng/L HgCl2对大鲵暴露24 h显著下调了大鲵皮肤CATH-BF基因表达水平，其中1、100 ng/L HgCl2对大鲵暴露24 h极显著下调了大鲵皮肤CATH-BF基因表达水平(P<0.01)，10 ng/L HgCl2对大鲵暴露24 h显著下调了大鲵皮肤CATH-BF基因表达水平(P<0.05)。10、100 ng/L HgCl2对大鲵暴露48 h显著诱导了大鲵皮肤CATH-BF基因表达水平(P<0.05)，暴露48 h后，1 ng/L HgCl2对大鲵皮肤CATH-BF基因表达水平无显著影响。HgCl2对大鲵暴露72 h对皮肤CATH-BF基因表达均无显著性影响。

*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)，下同

2.2 HgCl2对大鲵胰腺和心脏CATH-2基因相对表达水平的影响

暴露24、48、72 h后，HgCl2对大鲵胰腺和心脏CATH-2基因相对表达水平的影响见图2。结果显示，暴露24 h后，不同质量浓度HgCl2对大鲵心脏CATH-2基因表达水平具有不同的影响，即1、10 ng/L HgCl2对大鲵暴露24 h极显著下调了心脏CATH-2基因表达水平(P<0.01)，100 ng/L HgCl2对大鲵暴露24 h极显著上调了心脏CATH-2基因表达水平(P<0.01)。10、100 ng/L HgCl2对大鲵暴露48 h后显著下调了大鲵心脏CATH-2基因表达水平(P<0.05)，暴露48 h后，1 ng/L HgCl2对大鲵心脏CATH-2基因表达水平无显著影响。暴露72 h后，HgCl2对大鲵心脏CATH-2基因表达均无显著性影响。

图2 HgCl2对大鲵胰腺和心脏CATH-2基因相对表达水平的影响Fig.2 Effects of HgCl2 exposure on the relative expression of CATH-2 in the pancreas and heart of Andrias davidianus

HgCl2对大鲵暴露24 h后，大鲵胰腺CATH-2基因表达水平相对于对照组均呈现下降变化趋势，即10、100 ng/L HgCl2对大鲵暴露24 h显著下调了大鲵胰腺CATH-2基因表达水平(P<0.05)，1 ng/L HgCl2对大鲵暴露24 h后，大鲵胰腺CATH-2基因表达水平相对对照无显著变化。HgCl2对大鲵暴露48、72 h后，胰腺CATH-2基因表达均无显著性变化。

2.3 HgCl2对大鲵胰腺和心脏CATH-3基因相对表达水平的影响

暴露24、48、72 h后，HgCl2对大鲵胰腺和心脏CATH-3基因相对表达水平的影响见图3。结果显示，暴露24 h后，不同质量浓度HgCl2对大鲵心脏CATH-3基因表达水平具有不同的影响，即1、10 ng/L HgCl2对大鲵暴露24 h极显著诱导了心脏CATH-3基因表达水平(P<0.01)，然而暴露24 h后，100 ng/L HgCl2对大鲵心脏CATH-3基因表达水平无显著影响。HgCl2对大鲵暴露48、72 h后，心脏CATH-3基因表达均无显著性变化。

暴露24、48、72 h后，HgCl2对大鲵胰腺CATH-3基因表达均无显著性影响。

图3 HgCl2对大鲵胰腺和心脏CATH-3基因相对表达水平的影响Fig.3 Effects of HgCl2 exposure on the relative expression of CATH-3 in the pancreas and heart of Andrias davidianus

3 结论与讨论

CATH是一组在白细胞和上皮细胞中发现的阳离子肽，在哺乳动物物种早期先天免疫防御中起着重要作用，然而，CATH在两栖动物中报道很少。多项研究结果表明，CATH具有强大的抗菌活性、抗炎症功能及对哺乳动物细胞低毒性[16,26-27,34-36]。CATH在两栖动物中国大鲵中报道更少，仅YANG等[37]报道从中国大鲵中首次识别和鉴定了在皮肤中高表达的CATH，这是在有尾两栖动物研究中首次识别和鉴定抗菌肽，该研究还分析了重组抗菌肽潜在的抗菌活性。本研究发现，在受到外界环境HgCl2暴露时，大鲵皮肤、心脏和胰腺CATH的表达处于动态变化模式。据报道，大鲵养殖水体环境中存在一定水平的汞，汞暴露对两栖动物尤其是大鲵心脏和胰腺CATH家族基因的影响还没有报道。汞在一些哺乳动物体的各组织部位( 包括肝脏、肾脏、肺脏、脾脏、胰腺、肌肉和脑 ) 均检出[38]，所以汞可能引起各组织部位的毒性效应。到目前为止，大多数研究局限于汞诱导的神经毒性、肾毒性和肝毒性方面，有关汞诱导的皮肤、胰腺和心脏毒性研究较少。而汞诱导的皮肤、胰腺和心脏毒性研究也局限于大鼠、小鼠和人的细胞等一些模式物种。汞暴露被认为是心血管疾病的重要因素，会增加心血管疾病的风险，并导致严重的心脏毒性[39]。本研究从大鲵转录组数据中鉴定了CATH家族CATH-BF、CATH-2和CATH-3等3个基因，分析在HgCl2暴露大鲵后这几个基因在皮肤、心脏和胰腺组织中不同的表达模式，并且发现随着HgCl2暴露时间的不同基因表达模式也会发生变化。

3.1 HgCl2对大鲵皮肤CATH-BF基因表达的影响

众所周知，皮肤经常暴露于各种微生物病原体，是抵御微生物感染的第一道防线。 通过大量研究，两栖动物的颗粒状皮肤腺体合成并释放出多种抗菌肽，针对微生物提供有效和快速的防御作用。CATH是一种抗菌肽，其在皮肤中特异性表达表明其在针对大鲵细菌感染的先天免疫应答中具有重要功能。HgCl2对大鲵暴露24 h显著下调了大鲵皮肤CATH-BF基因表达水平。相关研究发现，CATH-BF具有抗炎症功能，可减轻外界刺激引起的皮肤炎症毒性效应[40-41]。推测HgCl2对大鲵短时间暴露导致大鲵皮肤CATH-BF基因表达水平的下降，从而引起皮肤分泌的CATH-BF蛋白水平下降，降低了对微生物的抵御能力及抗炎症活性，介导各种炎症性疾病。然而10、100 ng/L HgCl2对大鲵暴露48 h后通过免疫系统的调节显著诱导了大鲵皮肤CATH-BF基因表达水平(P<0.05)，说明环境中HgCl2暴露48 h会诱导大鲵皮肤CATH-BF基因表达，刺激皮肤分泌CATH-BF蛋白，抵抗HgCl2介导的炎症反应。暴露72 h，HgCl2对大鲵皮肤CATH-BF基因表达均无显著性影响，说明免疫系统的调节与外界环境HgCl2暴露达到平衡调节状态。

3.2 HgCl2对大鲵心脏CATH-2和CATH-3基因表达的影响

汞处理可诱导小鼠和大鼠的心脏炎症效应[42-43]。而CATH相关抗菌肽可减轻心脏炎症毒性[44]。因此，HgCl2对大鲵心脏CATH相关基因表达水平的影响有助于分析HgCl2对大鲵心脏的炎症毒性效应。本研究结果显示，暴露24 h后，不同质量浓度HgCl2对大鲵心脏CATH-2基因表达水平具有不同的影响，即1、10 ng/L HgCl2对大鲵暴露24 h极显著下调了心脏CATH-2基因表达水平，说明1、10 ng/L HgCl2对大鲵暴露24 h可能导致心脏CATH-2蛋白水平下降，降低心脏对微生物以及外界环境污染物的抵御能力及抗性，增加心脏炎症的风险。然而100 ng/L HgCl2对大鲵暴露24 h极显著上调了心脏CATH-2基因表达水平，说明100 ng/L HgCl2对大鲵暴露24 h可能会刺激大鲵免疫系统调节CATH-2基因表达，上调心脏CATH-2蛋白表达水平，增强对100 ng/L HgCl2刺激炎症的调节作用。10、100 ng/L HgCl2对大鲵暴露48 h后显著下调了大鲵心脏CATH-2基因表达水平。暴露72 h后，HgCl2对大鲵心脏CATH-2基因表达均无显著性影响。1、10 ng/L HgCl2对大鲵暴露24 h极显著诱导了心脏CATH-3基因表达水平(P<0.01)，然而暴露24 h后，100 ng/L HgCl2对大鲵心脏CATH-3基因表达水平无显著影响。暴露48、72 h后，HgCl2对大鲵心脏CATH-3基因表达均无显著性影响。因此，HgCl2对心脏CATH相关基因表达水平的影响可能通过对CATH蛋白表达水平的影响介导心脏炎症毒性，CATH-2和CATH-3基因表达水平的动态变化模式与大鲵自身免疫调节共同介导了大鲵心脏炎症毒性。

3.3 HgCl2对大鲵胰腺CATH-2和CATH-3基因表达的影响

胰腺分泌的抗菌肽在肠道先天免疫中发挥着关键作用[45]。SUN等[46]报道了胰岛β细胞如何表达CATH并在稳态或促炎条件下调节β细胞功能，发现CATH由大鼠胰岛素瘤β细胞克隆INS-1 832/13组成型表达，丁酸盐或苯基丁酸诱导了CATH表达，并且在IL-1β或LPS促炎症条件下促进CATH分泌。CATH通过表皮生长因子受体(EGFR)和通过调节抗凋亡Bcl-2家族蛋白的表达促进体外β细胞存活，表明CATH正调节β细胞功能，可能用于干预β细胞功能障碍相关疾病，外界环境刺激如环境污染物对胰腺CATH相关基因表达水平的影响可通过调节CATH的分泌水平从而使有机体产生肠道炎症、胰岛β细胞功能紊乱等炎症性疾病。POUND等[47]发现，当1型糖尿病易感大鼠糖尿病发展不发作时，肠道CATH相关基因表达上调，在大鼠、小鼠和人的胰腺β细胞中都发现了新的CATH相关基因表达，CATH相关基因表达在胰岛中下调从而介导了胰岛炎症发生。HgCl2对胰腺CATH相关基因表达水平的影响可介导肠道和胰腺炎症毒性。本研究发现，10、100 ng/L HgCl2对大鲵暴露24 h显著下调了大鲵胰腺CATH-2基因表达水平，暴露48、72 h后，HgCl2对大鲵胰腺CATH-2基因表达均无显著性影响，说明大鲵对HgCl2暴露环境具有适应性，推测大鲵长期暴露于HgCl2环境可能导致胰腺分泌抗菌肽不发生改变，降低大鲵对微生物的抗菌作用，对大鲵产生各种炎症毒性，进而导致生态毒理影响。暴露24、48、72 h后，HgCl2对大鲵胰腺CATH-3基因表达均无显著性影响，说明大鲵胰腺CATH-3基因在应对环境HgCl2暴露过程属于组成型表达模式，CATH-3在介导HgCl2引起的胰腺炎症毒性效应中抗炎症作用较弱。HgCl2对大鲵胰腺CATH相关基因表达水平的影响可能通过对CATH蛋白表达水平的影响介导胰腺炎症毒性，CATH-2基因表达水平的动态变化模式与大鲵自身免疫调节共同介导了大鲵胰腺炎症毒性。

综上所述，HgCl2对大鲵皮肤、胰腺和心脏CATH-BF、CATH-2和CATH-3基因表达水平的影响处于动态变化模式，CATH相关基因在大鲵皮肤、胰腺和心脏中的表达显示出组织特异性，可能介导各种炎症毒性，所以应严格限制大鲵水生境中汞水平，保护大鲵生态环境。具体有关CATH-BF、CATH-2和CATH-3在皮肤、心脏和胰腺中的功能，还需进一步进行深入分析。