中药石苦秦散及其有效成分对水禽源细菌的体外抑菌效果

张亚楠，徐景峨，蒲 龄，彭 珊，田青青，杨 莉，王 鑫，姜玲玲，余 波

(1.贵州省农业科学院 畜牧兽医研究所，贵州 贵阳 550005； 2.贵州师范学院，贵州 贵阳 550000)

鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌是引起水禽细菌性疾病的常见致病菌[1-4]。由于致病菌往往具有较多的血清型，且各血清型间无明显的交叉保护现象，导致疫苗在预防细菌性疾病上效果欠佳[1,5-6]。抗菌药物治疗是控制细菌病的常用方法，同时也是控制细菌病流行性暴发的重要途径。但是，由于细菌病发病时间不固定、频率高，养殖场往往擅自使用高浓度抗菌药物进行预防和治疗细菌性疾病，导致细菌产生严重的耐药性和抗菌药物残留，给养殖业和人类健康带来危害[7-8]。

目前，中药制剂作为抗生素替代品的研发成为研究热点。中药制剂具有广谱抗菌抗病毒、提高机体免疫力、不易产生耐药性、残留小等方面的特点[9-10]。中药五倍子及单体没食子酸(即五倍子酸)对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌均有较好的抑制作用[10-11]。鞣花酸对大肠杆菌、沙门氏菌有较好的抑制作用[12]，秦皮乙素对产KPC型碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌具有一定的抑制作用[13]。鉴于此，将石榴皮、苦参、秦皮配伍使用，经提取和喷雾干燥制得的中药复方制剂石苦秦散，对猪源大肠杆菌具有较好的抑菌效果，MIC和MBC分别介于7.81～15.63 g/L和15.63～31.25 g/L[9]。但是，中药制剂对水禽源多重耐药菌株的抑菌效果及杀菌效果研究相对较少。为此，探究石苦秦散及其6种主要活性成分(苦参碱、氧化苦参碱、秦皮甲素、秦皮乙素、鞣花酸、没食子酸)单体对引起水禽疾病的常见菌种(鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌)的抑菌作用，综合评价中药复方制剂石苦秦散对水禽源细菌病治疗效果，为石苦秦散治疗畜禽常见细菌性疾病提供理论依据，以期为“减抗化”生态养殖的发展提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 大肠杆菌ATCC®25922标准株、沙门氏菌ATCC®13076标准株、金黄色葡萄球菌ATCC®6538标准株均由贵州省畜牧兽医研究所兽用中草药研究室保存。5株鸭疫里氏杆菌、5株鸭源大肠杆菌、2株鸭源多杀性巴氏杆菌、2株鸭源沙门氏菌均由贵州省畜牧兽医研究所畜禽疫病研究室分离保存。菌株具体信息见表1。

1.1.2 试剂与培养基 21种细菌药敏纸片均购自杭州滨和微生物试剂有限公司。二甲基亚砜(DMSO)、无水乙醇、甲醇等购自广州化学试剂厂。秦皮甲素、秦皮乙素、没食子酸、鞣花酸、苦参碱、氧化苦参碱均购自西安开来生物工程有限公司。石苦秦散(包装规格：100 g/袋；由石榴皮、苦参、秦皮经水提后喷雾干燥制得， 批号：20180520)由贵州省农业科学院畜牧兽医研究所、 成都乾坤动物药业有限公司合作提供。

水解酪蛋白肉汤(MH broth)、水解酪蛋白琼脂(MH agar)、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂(XLD)、沙门氏菌显色培养基(CHRO magarSalmonellaagar)、麦康凯琼脂(Mac conkey agar)、甘露醇琼脂、胰蛋白胨大豆琼脂培养基(Tryptic soy agar，TSA)、胰蛋白胨大豆肉汤(Tryptic soy broth，TSB)等均购自广州环凯微生物科技有限公司。酵母提取粉(Yeast extract)购自英国OXOID公司。新生牛血清购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

1.2 试验方法

1.2.1 药液制备 将每种中药单体及石苦秦散复方制剂用相应的溶剂溶解，再加灭菌超纯水定容，配制成一定质量浓度的母液，灭菌后置 4 ℃冰箱保存备用。药物配制所用溶剂和稀释剂见表2。

表1 14株鸭源分离株的信息Tab.1 Information of 14 isolates from duck farms

表2 石苦秦散及其主要活性成分单体的配制Tab.2 The preparation of Shikuqin powder and its main active component monomers

1.2.2 菌液制备 将大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌接种于含MH液体培养基的试管中，置于37 ℃、200 r/min条件下培养12 h。将多杀性巴氏杆菌接种于含MH液体培养基(含5%血清)的试管中，置于37 ℃、200 r/min条件下培养18 h。将鸭疫里氏杆菌接种于含TSB液体培养基(含0.5%酵母提取物、5%血清)的试管中，置于37 ℃、200 r/min条件下培养18 h。分别用其相应的液体培养基调整菌液的OD600为 0.8，再用培养基稀释1 000倍，相当于菌液浓度为105～106cfu/mL，备用。

1.2.3 耐药表型的测定 参照美国临床实验室标准化委员会(Clinical and laboratory standards institute，CLSI)的指导原则，采用药敏纸片法检测本研究中所用的3株标准株和14株分离株对21种抗菌药物的敏感性。其中，以大肠杆菌ATCC®25922作为质控菌株。大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌所用培养基为MH琼脂平板；多杀性巴氏杆菌所用培养基为加5%新生牛血清的MH琼脂平板；鸭疫里氏杆菌所用培养基为加5%新生牛血清的TSA琼脂平板。

由于缺少CLSI批准的适合鸭疫里氏杆菌的药物敏感折点值，受试药物的质控范围及敏感折点值判断标准主要参考CLSI动物源细菌药敏试验标准和人医CLSI细菌药敏试验标准规定的适用于大肠杆菌的判定标准。药敏试验结果参考CLSI规定的敏感(Susceptible，S)、中介(Intermediate，I)、耐药(Resistance，R)折点值范围判断结果。

1.2.4 最小抑菌浓度(MIC)的测定 采用微量肉汤二倍稀释法，于无菌96孔板每一孔中均加入100 μL肉汤，再分别向第一孔中加入100 μL配备好的药液，混匀后依次倍比稀释，直到最后一孔混匀后弃去100 μL混合液。每孔加入配备好的100 μL细菌稀释液。同时设置阳性对照组(加菌不加药)和阴性对照组(不加菌不加药)。此外，在正式试验之前还需设置有机溶剂对照组，即对每株菌进行有机溶剂的对照试验，将药液换成有机溶剂(甲醇、乙醇和DMSO)，从而测定能保证所有供试菌株存活的最大溶剂含量，以便制备药液所用的溶剂含量远低于此值。37 ℃恒温培养24 h后取出，观察细菌生长情况。每组试验至少重复3次。

采用TTC法对MIC结果进行判定。向上述培养24 h后的96孔板每孔分别加入20 μL 0.5%的2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)，37 ℃避光培养2 h，观察菌液的颜色变化。试验组眼观溶液澄清、颜色未发生变化的最低药物质量浓度则作为该药的MIC。

1.2.5 最小杀菌浓度(MBC)的测定 将上述试验组澄清的各孔中液体取100 μL涂布于相应的营养培养基上，于37 ℃培养48 h观察结果。以肉眼观察无菌落生长的最低药物质量浓度为其MBC。

2 结果与分析

2.1 临床分离株耐药表型

以大肠杆菌ATCC®25922作为质控菌株，选用的药敏纸片均在质控范围内。沙门氏菌ATCC®13076除对林可胺类抗生素克林霉素耐药外，对其余20种药均敏感；金黄色葡萄球菌ATCC®6538对所选用的21种药物均敏感，沙门氏菌ATCC®13076和金黄色葡萄球菌ATCC®6538作为敏感对照组。检测到14株临床分离株除PmSS5外，其余均为多重耐药株。肠杆菌属的大肠杆菌和沙门氏菌分离株耐药性较强，耐药种数最多，均高于8种，其中ECSS7耐药种数高达13种；其次是鸭疫里氏杆菌，耐药种数介于5～8种，主要是对氨基糖苷类耐药严重。2株水禽源多杀性巴氏杆菌较为敏感，PmSS5仅对克林霉素和人工合成的抗菌药磺胺异恶唑耐药。克林霉素适用于革兰氏阳性菌引起的各种感染性疾病，对革兰氏阴性菌作用效果差，通常用于治疗厌氧细菌以及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的感染。磺胺类药物为比较老的人工合成抗菌药物，14株分离株均对其耐药(表3、4)。

表3 14株分离株对21种抗菌药物的耐药情况Tab.3 Resistance of 14 isolates to 21 antibiotics

续表3 14株分离株对21种抗菌药物的耐药情况Tab.3(Continued) Resistance of 14 isolates to 21 antibiotics

注:S为敏感，I为中介，R为耐药。

Note:S is susceptible,I is intermediate and R is resistance.

表4 14株分离株的耐药表型及耐药种数Tab.4 Resistant phenotype and Resistant species of 14 isolates

2.2 石苦秦散及6种主要活性成分单体的抑菌作用

由表5可知，石苦秦散及6种单体对17株细菌均有抑菌作用。石苦秦散对17株细菌的MIC介于1.95～62.50 g/L；其中，对鸭疫里氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的MIC介于1.95～15.63 g/L；对大肠杆菌、沙门氏菌以及金黄色葡萄球菌的抑菌效果相对弱一些，MIC介于15.63～62.50 g/L。

由图1可看出， 6种单体抑菌能力最强的为秦皮乙素，其次为苦参碱、没食子酸。苦参碱除对金黄色葡萄球菌6538的MIC(15.63 g/L)较高外，其余均低于7.81 g/L。氧化苦参碱除对鸭疫里氏杆菌的MIC相对较低，介于3.91～15.63 g/L，对其余4种细菌的MIC均大于31.25 g/L。可见，氧化苦参碱的抑菌作用明显弱于苦参碱。秦皮甲素对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的MIC高于另外4种革兰氏阴性菌，且对鸭疫里氏杆菌的抑菌作用最强，MIC介于3.91～7.81 g/L。秦皮乙素对革兰氏阴性菌的抑菌效果也强于革兰氏阳性菌，且对4种革兰氏阴性菌的MIC均小于1.95 g/L。没食子酸对鸭疫里氏杆菌和多杀性巴氏杆菌表现出较强的抑菌效果，对鸭疫里氏杆菌的MIC介于0.03～0.98 g/L，对多杀性巴氏杆菌的MIC为1.95 g/L。鞣花酸对不同种属菌株的抑菌作用存在较大差异，对鸭疫里氏杆菌的抑菌效果最好，MIC介于0.49～1.95 g/L；鞣花酸对同种菌属的不同细菌也存在差异，如大肠杆菌25922、ECSS7的MIC分别为0.98 g/L和0.49 g/L，而其他4株大肠杆菌的MIC均高于31.25 g/L。

大肠杆菌ATCC®25922标准株为敏感株，但和其他多重耐药大肠杆菌相比MIC区别不大，说明石苦秦散及6种单体的抑菌作用与菌株的敏感程度无关。沙门氏菌ATCC®13076、金黄色葡萄球菌ATCC®6538、多杀性巴氏杆菌分离株PmSS5均为敏感株，和其他耐药菌株相比未表现出较低的MIC。

2.3 石苦秦散及其6种主要活性成分单体的杀菌作用

由表5可知，石苦秦散及其6种单体对17株细菌均有杀菌效果。石苦秦散对17株菌的MBC介于1.95～125.00 g/L。6种单体体外杀菌试验结果表明，当质量浓度达到31.25 g/L时，没食子酸能杀死所有供试菌株，整体杀菌效果优于其他5种单体(图2)。氧化苦参碱、鞣花酸、秦皮甲素、秦皮乙素4种单体对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌杀菌效果相对弱一些，MBC为125.00 g/L。秦皮乙素、没食子酸对多杀性巴氏杆菌的MBC和MIC相等，分别为0.12 g/L和1.95 g/L，说明这2种中药单体对多杀性巴氏杆菌的抑菌效果和杀菌效果相同。石苦秦散复方制剂和6种中药单体对5株鸭疫里氏杆菌的MBC和MIC均相差不大，且均低于其他菌株，说明这些中药对鸭疫里氏杆菌的抑菌效果和杀菌效果相对较好。

表5 石苦秦散及其6种主要活性成分单体的抑菌/杀菌效果

图1 石苦秦散及6种有效成分单体对17株细菌的MIC分布

图2 石苦秦散及6种有效成分单体对17株细菌的MBC分布

3 结论与讨论

目前，治疗水禽细菌性疾病主要是使用抗生素，然而不合理的使用加剧了多重耐药菌株的出现[14-15]。本研究所用的14株分离株，90%为多重耐药菌株，肠杆菌属的大肠杆菌和沙门氏菌分离株最为耐药，耐药种数最多，均高于8种，其中大肠杆菌ECSS7耐药种数高达13种，鸭疫里氏杆菌的耐药种数介于5～8种，可见水禽源细菌耐药性普遍严重，为水禽源细菌病的治疗带来很大难题。当前我国正在实施退出行动、减抗行动。减抗初期会导致治疗抗菌药用量增加、养殖生产性能下降以及食品动物感染性疾病发病率增加[16]，如何安全度过减抗期，发挥我国传统中药的优势，寻找新的抗生素替代物且不产生耐药成为防治细菌性疾病的新途径。

本研究发现，中药复方制剂石苦秦散对鸭疫里氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌均有抑菌作用和杀菌作用，MIC介于1.95～62.50 g/L，MBC介于1.95～125.00 g/L。YU等[9]报道的石苦秦散对仔猪腹泻型大肠杆菌的MIC与MBC分别为7.81～15.63 g/L、15.63～31.25 g/L，与本研究中，石苦秦散对多重耐药的大肠杆菌的MIC和MBC较为接近，说明石苦秦散对大肠杆菌普遍具有良好的抗菌效果。此外，石苦秦散对鸭疫里氏杆菌抑菌效果和杀菌效果明显优于其他菌株，MIC与MBC较低，且均介于1.95～15.63 g/L，在临床上具有很高的应用价值[17]。由于鸭疫里氏杆菌极易产生耐药性，寻求新的、安全可靠的治疗方法是必要的。

6种中药单体中，抑菌能力最强的为秦皮乙素，除对金黄色葡萄球菌6538的MIC较高(15.63 g/L)，对其余16株菌的MIC介于0.03～1.95 g/L。但是，秦皮乙素的杀菌效果因菌种不同而存在差异，其对鸭疫里氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的杀菌效果较好，MBC介于0.03～0.49 g/L；而对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的MBC均高于62.50 g/L。值得注意的是，秦皮甲素和秦皮乙素对大肠杆菌都具有较好抑菌作用，MIC分别为15.63 g/L和0.49～0.98 g/L，这和DUNCAN等[18]报道的秦皮甲素和秦皮乙素能够减少动物肠道中大肠杆菌数量相符。但是秦皮甲素和秦皮乙素对大肠杆菌的MBC分别为125.00 g/L和62.50～125.00 g/L，说明杀菌效果欠佳，这可能与大肠杆菌某些血清型有一定的关系。在6种中药单体杀菌效果试验中，对5种供试菌杀菌效果最好的为没食子酸，当浓度达到31.25 g/L时，没食子酸能杀死所有供试菌株，整体杀菌效果优于其他5种单体。其中，没食子酸对金黄色葡萄球菌的MIC和MBC分别为7.81 g/L和31.25 g/L，这与LIU等[19]的报道相符。

本研究中，中药单体秦皮乙素、没食子酸以及鞣花酸对鸭疫里氏杆菌均表现出良好的抑菌效果和杀菌效果，MIC为0.03～0.12 g/L、0.03～0.98 g/L和0.49～1.95 g/L，MBC与MIC相差不大，这些中药单体为开发治疗传染性浆膜炎药品提供了一个新的思路。鸭疫里氏杆菌本身具有产膜能力，而没食子酸通过抑制细菌生物膜主要成分多糖的合成来抑制其形成，从而起到杀菌的效果[20]。同时，中药单体秦皮乙素、没食子酸对多杀性巴氏杆菌的MBC和MIC相同且较低，分别为0.12 g/L和1.95 g/L，在临床上具有一定的使用价值，也为禽霍乱的治疗提供了新的思路。

此外，本研究还表明，石苦秦散复方制剂和6种中药单体的抑菌作用或杀菌作用，均与菌株对抗生素的敏感程度无关，这对中药制剂控制细菌耐药性提供了可能。