移植患者CD4+CD25+CD127low调节性T细胞、TGF-β1 及IL-10的表达

周文超，黄生耀，李 薇，熊小敏，蔡祥胜，郭 煜，冯红梅，徐晓松，陈思聪

(1.沈阳急救中心 急诊科，辽宁沈阳 110000；2.广州军区广州总医院/广州军区检验中心，广东广州510010；3.东莞仁康医院检验科，广东东莞 523952；4.广东药科大学附属第一医院检验科，广东广州 5 10080)

目前，大量的动物实验及临床研究均表明,调节性T细胞(Treg细胞)在移植免疫耐受的形成密切相关，一部分器官移植的受者逐渐对移植器官产生免疫耐受，将这部分受者血液中的CD4+T细胞被动地转移给其他宿主，也能获得同样的免疫耐受效果，此即“主动移植耐受”。Treg细胞发挥免疫抑制功能与一些细胞因子，如白细胞介素(IL)-2、IL-10、转化生长因子β(TGF-β)等[1]。本研究通过分析肝肾移植患者前后外周血中Treg细胞的百分比的变化及细胞因子的表达，进一步了解Treg和细胞因子与移植免疫耐受的相关性，为临床移植免疫耐受研究提供新思路。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2012年5-12月广州军区广州总医院肝胆外科及泌尿外科肝肾移植患者15例为移植组。其中肾移植7例，肝移植8例；男12例，女3例；年龄23～64岁，平均46岁。

1.2试剂 试剂为CD4-FITC、CD25-PE、Mouse Anti-Hunan CD127-PerCP-CyTM5.5、MouseIgG1-PE、MouseIgG1-PerCP-Cy5.5、溶血剂、鞘液，均购自美国BD Biosciences公司。TGF-β1、IL-10试剂盒均购自德国IBL(IBL International GmbH)公司。

1.3实验方法 清晨空腹采取静脉血2 mL，用乙二胺四乙酸三钾(EDTA-K3)抗凝，每份标本设测定、同型对照2管，分别于2管中各加入100 μL抗凝血后，于测定管中加入CD4-FITC 10 μL、CD25-PE 10 μL、PerCP-CyTM 5.5 Mouse Anti-Hunan CD127 2 μL，同型对照加入CD4-FITC、MouseIgG1-PE各10 μL，MouseIgG1 percp-Cy5.5 2 μL，振荡混匀，室温避光标记15 min；加入1 mL溶血剂，振荡混匀，室温避光溶血10 min；2 000 r/min离心2 min弃上清液，加鞘液1 mL，2 000 r/min离心2 min，弃上清液，加入鞘液500 μL充分混匀后上机分析。用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒检测患者外周血血清中TGF-β1、IL-10的水平，操作按照试剂盒说明书进行。

2 结 果

2.1器官移植患者移植前与对照组CD4+CD25+CD127lowTreg细胞的比较 器官移植患者为15例，其中肾功能不全，尿毒症期肾移植为7例；肝癌肝硬化8例。移植组CD4+CD25+CD127lowTreg细胞百分比为(5.60±2.11)%，对照组为(3.80±1.15)%，差异有统计学意义(P=0.003)；移植组高于对照组，存在显著性差异。见图1。

注：移植前与对照组比较，*P<0.05。

图1移植组移植前与对照组外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg细胞的比较

2.2移植前与移植后CD4+CD25+CD127lowTreg细胞的比较 移植组CD4+CD25+CD127lowTreg细胞百分比为(5.60±2.11)%，移植后变为0，CD4+CD25+CD127lowTreg细胞移植前后存在显著性差异，其差值的均数为5.60，标准差为2.11。见图2。

注：A、B均为移植前Treg细胞的百分比；C为移植后Treg细胞的百分比。

图2移植前与移植后CD4+CD25+CD127lowTreg细胞

2.3器官移植前CD4+CD25+CD127lowTreg细胞的百分比与TGF-β1、IL-10水平的相关性 移植前患者CD4+CD25+CD127lowTreg细胞的百分比为(5.60±2.12)%，TGF-β1水平为(728.32±356.26)ng/L，IL-10水平为(481.85±124.04)ng/L。TGF-β1和IL-10的水平与CD4+CD25+CD127lowTreg细胞百分比均呈正相关(r=0.627，P=0.012；r=0.544，P=0.036)。见图3。

注：A表示与TGF-β1的相关性；B表示与IL-10的相关性。

图3移植前Treg细胞的百分比与TGF-β1、IL-10水平的相关性

2.4器官移植前后TGF-β1、IL-10水平的比较 器官移植前TGF-β1水平为(728.32±356.26)ng/L，移植后TGF-β1水平为(685.46±281.06)ng/L，移植前高于移植后，经统计分析，差异无统计学意义(P=0.308)。器官移植前IL-10水平为(481.85±124.04)ng/L，移植后水平为(458.51±95.89)ng/L，移植前高于移植后，经统计分析，差异无统计学意义(P>0.05)。见图4。

注：同一指标移植前后的比较，*P>0.05。

图4器官移植前后TGF-β1、IL-10细胞因子水平的比较

3 讨 论

肝肾移植是治疗肝肾疾病终末期的有效治疗方法，能延长人的生命。Treg及相关细胞因子可能与移植免疫耐受密切相关，研究移植后急性排斥反应的早期诊断，如何降低术后排斥反应的发生，诱导免疫耐受的形成仍然是当前乃致今后一段时间在此领域的研究热点。

相关的研究数据表明，肝移植术后，占比进行肝脏移植术总人数的25%～33%患者完全接受肝脏移植物，这与其受体内Treg细胞的异常表达有关[2]。诱导型Treg主要通过分泌细胞因子IL-10及TGF-β等发挥免疫抑制作用，IL-10 及TGF-β细胞因子在一定程度上也可诱导Treg 的分化，两者相互作用[3-4]。

罗文峰等[5]研究报道显示,肾移植术前第1～2天，急性排斥组和稳定组的Treg细胞水平比较差异有统计学意义(P<0.05)。术后4周内2组Treg细胞水平均急剧下降。术后第4～8周，稳定组受者的Treg细胞水平开始回升，而急性排斥组继续下降。术后第8～12周，稳定组的Treg细胞水平明显回升，但排斥组则仍维持在较低水平，且此阶段2组Treg细胞水平的差异有统计学意义(P<0.05)。

有研究发现，发生急性排斥反应的肝移植体患者体内CD4+CD25+Treg细胞的量显著低于未发生排斥的患者，这表明提高受体循环中CD4+CD25+Treg细胞的量可能有利于肝移植的存活。钟嘉明[5]的研究报道显示，肝移植术后，外周血CD4+CD25+Treg细胞百分比暂时下降，1年内逐渐恢复，其下降的原因可能与应用大量免疫抑制剂及激素有关。肝移植病人肝功能长期稳定时，外周血中的Treg细胞百分比与他克莫司血药浓度有关，高血药水平受者Treg细胞百分比显著降低，低血药水平受者Treg细胞水平虽有降低，但差异无统计学意义[6]。

本研究结果显示，CD4+CD25+CD127lowTreg细胞移植组显著高于对照组。肝移植患者中，都是肝癌患者，既往的研究中肝癌组高于健康人群。移植患者移植后1、2、3周后CD4+CD25+CD127lowTreg细胞下降为0，与上述的报道存在差异[7]。Treg下降为0，可能原因为：(1)移植术后，Treg细胞重新分布于移植物、外周血和淋巴组织中，引起外周血中Treg细胞水平降低；(2)急性排斥反应时，大量的炎症趋化因子使Treg细胞向移植物迁移，外周血中Treg细胞水平进一步降低；(3)应用大量的免疫抑制剂，可引起Treg细胞百分比降低。本研究观察到随着移植术成功至6周开始出现Treg细胞的表达，表达范围在0～1%，由于时间短暂，患者出院，未能继续跟踪，但从移植后来院复查的患者中观察到，Treg细胞在移植半年到5年后，表达范围在3%～11%。

器官移植前CD4+CD25+CD127lowTreg细胞占CD4+T淋巴细胞百分比与TGF-β1、IL-10水平呈正相关，差异有统计学意义，与于丹军等[7]在妇科肿瘤研究结果相一致。表明Treg 可能通过引起TGF-β、IL-10 上调而发挥免疫抑制的作用。

移植患者TGF-β1、IL-10的水平下降，移植前高于移植后，但经统计分析，差异无统计学意义(P>0.05)。可能与移植前患者体内存在的TGF-β1、IL-10水平有关。具体机制尚不清楚，有待进一步的观察研究。

4 结 论

Treg细胞及细胞因子在器官移植免疫中发挥着重要的作用，本研究观察Treg细胞与细胞因子TGF-β1、IL-10水平在移植前呈正相关。Treg细胞在移植后数周下降为0，几周后缓慢出现表达，细胞因子移植后下降。临床中有关Treg细胞与细胞因子在移植前后监测的数据稀少，还需要更多的研究来明确这类细胞作为一种免疫指标的作用。