胆石病患者胆汁酸代谢轮廓分析1

段银环，毕小云△，邵 勇，李 欢

(重庆医科大学附属第一医院：1.检验科；2.产科，重庆 400046)

胆石病是临床最常见的消化系统疾病之一，其成石机制目前仍不十分清楚。研究表明,胆石病发病的根源是胆汁酸代谢紊乱及胆固醇稳态的破坏[1]。胆汁酸代谢轮廓是反映生物体内胆汁酸种类、水平、变化的指标。当肝脏发生病变或患胆管疾病时会引起胆汁酸代谢障碍，总胆汁酸早期不会发生明显改变，而血清中各种亚型胆汁酸水平将产生相应的变化，使血清中胆汁酸成分与水平显著改变[2]。监测人体内胆汁酸代谢轮廓的特征有望用于肝胆疾病的早期诊断及鉴别诊断。因此，需要对胆石病患者血清中胆汁酸进行全面分析，以充分掌握与成石有关的胆汁酸的毒性作用及发现具有早期诊断作用的标志胆汁酸。本研究采用超高效液相色谱-串联质谱分析法同时检测胆石病患者和健康志愿者(对照)血清中15种胆汁酸的水平，结合主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)建立诊断区分模型，并初步探讨血清胆汁酸代谢轮廓分析对胆石病的初步诊断价值及可能的成石机制。

1 资料与方法

1.1一般资料 共收集2018年1月至2019年1月到重庆医科大学附属第一医院就诊的胆石病患者及健康志愿者共84例为研究对象，其中对照组51例，胆石病组33例。清晨采集研究对象的空腹静脉血3 mL，待标本凝固后离心，提取上层血清保存于-80 ℃冰箱直至上机分析。对照组纳入标准：赴重庆医科大学附属第一医院体检健康者；平均每天摄入乙醇量<20 g；在同期的医学检查中，肝肾功及血脂处于正常参考区间内；无人患有糖尿病和血脂异常等内分泌系统疾病；无被诊断为胆结石或有任何肝肾功能障碍疾病或其他血液系统及呼吸系统疾病。胆石病组纳入标准：经影像学B超和(或)CT、MRI及逆行胰胆管造影(ERCP)检查确诊的胆石病患者，除外各种类型肝炎及其他原因引起的肝脏损伤，不合并糖尿病、代谢综合征及其他慢性疾病。

1.2仪器与试剂 Waters Xevo TQD IVD 串联质谱；Acquity UPLC I-Class超高效液相色谱仪；Masslynx 4.1工作站(美国Waters公司)；色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(50.0 mm×2.1 mm,1.7 μm)；Cobas c701全自动生化分析仪；甘氨石胆酸(GLCA)标准品购自Toronto Research Chemicals公司；胆酸(CA)、石胆酸(LCA)、脱氧胆酸(DCA)、熊脱氧胆酸(UDCA)、鹅脱氧胆酸(CDCA)、牛磺胆酸(TCA)、甘氨胆酸(GCA)、牛磺石胆酸(TLCA)、牛磺脱氧胆酸(TDCA)、牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)、牛磺鹅脱氧胆酸(TCDCA)、甘氨脱氧胆酸(GDCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)、甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)标准品及同位素标记的内标氘代胆酸(d4-CA)、氘代脱氧胆酸(d4-DCA)、氘代熊甘氨胆酸(d5-GCA)、氘代熊脱氧胆酸(d4-UDCA)、氘代石胆酸(d4-LCA)均购自Sigma Aldrich公司。

1.3方法

1.3.1血清标本前处理 在0.25 mL血清标本中,加入1 mg/mL 内标(3，12-二醇-7-一醇-5β-胆酸)甲醇液10 μL,加入甲醇4 mL，超声震动20 min，4 000 g离心20 min，上清液在60 ℃用氮气吹干。先依次各用2 mL的氯仿-甲醇(2∶1 V/V)、甲醇和水活化C18小柱。吹干的血清溶于1 mL水中,上样。依次用2 mL水、2 mL正己烷冲洗,最后用5 mL甲醇洗脱。在60 ℃用氮气吹干，残余物溶于1 mL乙腈-水(1∶1)中。

1.3.2色谱和质谱条件 色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(50.0 mm×2.1 mm,1.7 μm)；流动相：A相为0.1%甲酸水溶液(体积比)，B相为0.1%甲酸-乙腈：甲醇(3∶1,v∶v)溶液； 流速：0.4 mL/min；柱温：45 ℃；梯度洗脱程序：0～2.0 min,>35%～43%,B;>2.0～3.5 min,>43%～46%,B;>3.5～5.0 min,>46%～<59%,B;>5.0～7.0 min,59%,B;>7.0～8.7 min,>59%～66%,B;>8.7～10.7 min,>66%～98%,B;>10.7～11.3 min,35%,B。离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应监测(MRM)模式；毛细管电压：3.0 kV；离子源温度：150 ℃；脱溶剂气温度：400 ℃；脱溶剂气流速:800 L/h；锥孔气流速:50 L/h。用时间分段来提高待测物响应值，15种胆汁酸质谱参数见表1。

1.3.3方法学评价及质控 15种胆汁酸在1.0～6 000.0 nmol/L线性范围内线性关系良好，线性决定系数(R2)均>0.993；目标物的定量限为1.0～10.0 nmol/L；低、中、高水平的萃取回收率在95.5%～114.1%，日内、日间精密度(RSD)均<11.4%，15种胆汁酸的高低质控变异系数<15%。

表1 15种胆汁酸质谱参数

1.3.4特征标志胆汁酸的筛选 将数据导入SIMCA 13.0 (Umetrics 瑞典)软件，结合PCA和OPLS-DA对血清胆汁酸谱进行分析，建立模式识别模型。再根据所得的投影重要性值(VIP)及其置信区间对标志物进行初步筛选，获得对分组有贡献的胆汁酸变量。筛选标准为：VIP>1且置信区间不包括0的胆汁酸。对初筛的标志物进行不同组间的非参数检验以寻找有差异的特征标志胆汁酸。

2 结 果

2.1一般临床资料 对照组与胆石病组相比，性别构成(χ2=1.706,P=0.191)、直接胆红素(DBil)(t=-2.020，P=0.052)差异无统计学意义，可排除性别对胆汁酸谱的影响。2组年龄、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、总碱性磷酸酶(ALP)、总胆汁酸(TBA)、总胆红素(TBil)比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 对照组与胆石病组一般资料比较

注：与对照组比较，aP<0.05。

2.2构建区分模型 将得到的胆汁酸数据导入SIMCA13.0软件先进行无监督的PCA分析，根据DModX及Loading plot对异常离群点(outlier)反复剔除后建立PCA模型，模型解释力(R2X=83.9%)，预测力(Q2=43.9%)，见图1。依据筛除后的数据构建有监督的OPLS-DA模型，见图2。交叉验证显示预测能力Q2=20.8%，50.9%的变量[R2(X)]可用于解释26.3%的组间差异[R2(X)]。从3D得分图中可以看出对照组分布在右侧，胆石病患者分布在左侧，该模型筛选到的标志胆汁酸有GCDCA、CDCA、GUDCA、TUDCA、GCA、TDCA、TLCA、TCDCA、TCA。

注：N代表对照组，S代表胆石病组。A代表二维得分图，B代表3D得分图。

图1基于对照与胆石病组的PCA模型

注：N代表对照组，S代表胆石病组。A代表二维得分图，B代表3D得分图。

图2基于对照与胆石病组的OPLS-DA模型

表3 健康对照与胆石病胆汁酸代谢轮廓[nmol/L,M(P25,P75)]

注：与对照组相比，aP<0.05,bP<0.01。

2.3特征胆汁酸临床价值评估 为探索这些标志胆汁酸对胆石病的诊断效能，将胆石病与对照组进行非参数检验，寻找有差异的标志胆汁酸。见表3。与对照组相比，胆石病组的GCDCA、CDCA、TUDCA、GCA、TDCA、TLCA、TCDCA、TCA差异均有统计学意义(P<0.05)，其中GCDCA、CDCA、TUDCA、GCA、TDCA、TCDCA、TCA差异有显著统计学意义(P<0.01)。对差异胆汁酸进行ROC曲线分析并计算他们的AUC，胆石病组TLCA的AUC为0.615(P<0.05)，认为有较好的区分效能,表4、见图3。

表4 胆石病差异胆汁酸的AUC及P值

图3 胆石病差异胆汁酸的ROC曲线及AUC

3 讨 论

PCA是将多个指标的数据进行降维化为少数几个指标的一种方法,它在尽可能保留原有信息的基础上将样本指标数压缩,使数据矩阵简化,降低维数,PCA是通过分析可观测的指标,提取几个较少的综合指标以揭示原来变量绝大多数信息的一种多元统计方法[3-5]。OPLS-DA是将正交信号校正方法(OSC)与偏最小二乘法(PLS)相互结合同时对偏最小二乘法进行改进。OPLS-DA可以更好地区分组间差异,提高模型的有效性和解析能力。目前，OPLS-DA在代谢组学研究中已经被广泛应用，其应用价值也不断被认可[6-7]。

胆石病是多因素作用的结果，研究表明胆石病发病的根源是胆汁酸代谢紊乱及胆固醇稳态的破坏。本研究采用超高效液相色谱-串联质谱分析方法同时检测胆石病患者和健康志愿者血清中15种胆汁酸的水平并分析胆汁酸亚组份的差异，建立区分模型，探讨可能的成石机制。本研究结果显示，与对照组相比，胆石病组的GCDCA、CDCA、TUDCA、GCA、TDCA、TLCA、TCDCA、TCA水平差异均有统计学意义(P<0.05)，可以作为胆石病的标志胆汁酸，其中TLCA有一定的区分效能。

既往有研究表明，游离型胆汁酸的差异主要影响胆石病的形成[8]，这与本研究结果不符，本研究中，有差异的除CDCA是游离型胆汁酸外，GCDCA、TUDCA、GCA、TDCA、TLCA、TCDCA、TCA均为结合型胆汁酸，胆汁酸的毒性通常与其两亲性有关，大量毒性胆汁酸的堆积可诱导肝细胞的氧化应激及凋亡，最终导致肝脏实质损伤。有研究表明，DCA、LCA是毒性最大的疏水胆汁酸[9-11]，在本研究中未见明显升高。事实上，牛磺结合胆汁酸和甘氨结合型胆汁酸都是疏水性胆汁酸，具有相似的细胞毒性作用[10,12-14]。本研究中胆石病组GCDCA、TUDCA、GCA、TDCA、TLCA、TCDCA、TCA，与对照相比，差异均有统计学意义，可能是成石的主要因素，同时也可以解释胆石病患者的肝功能损害。

LCA是CDCA在肠道细菌的作用下脱羟基形成的一种次级胆汁酸，既往有研究表明，LCA在无症状的胆石病患者血清中可测出，而在健康人血清中检测不出，认为LCA可以用来鉴别胆石病的有无[15]，但也有学者在健康人血清标本中检测出LCA[16]。在本研究中，LCA与对照比较，差异无统计学意义，而CDCA及TLCA水平差异有统计学意义，结合本研究结果，认为可以将血清TLCA作为区分胆石病与非胆石病的指标。

既往研究表明，血清DCA水平增多是结石形成的诱发因素之一[17]，本实验中胆石病组血清样本中DCA水平与对照组差异无统计学意义。综上所述，DCA在胆固醇结石形成中的作用存在争议，仍需进一步研究。

4 结 论

本研究中结合胆汁酸GCDCA、TUDCA、GCA、TDCA、TLCA、TCDCA、TCA的差异主要影响胆石的形成；TLCA可能是鉴别胆石病与非胆石病的指标，胆汁酸代谢轮廓对临床诊断胆石病有较大的应用价值，有望用于胆石病的早期诊断及鉴别诊断。