异常免疫表型模式在急性髓系白血病微小残留检测中的应用1

母 璨，叶远馨，应斌武

(四川大学华西医院实验医学科,四川成都 610041)

急性髓系白血病是髓系造血干/祖细胞克隆性恶性增殖的血液系统疾病，以髓系原始细胞和幼稚细胞的恶性增殖为主要特征。虽然其临床缓解率可达80%以上[1]，但仅30%～40%的年轻患者和不及20%的老年患者能达到长期无病生存[2-4]。复发仍是困扰白血病治愈的一个难点。而形态学方法评价疗效及预后存在不足，治疗后达到完全缓解的患者中很多人会在不同时间间隔后复发。此时微小残留病(MRD)检测的出现为解决这一临床问题提供了可能性。MRD是指白血病患者经诱导化疗或骨髓移植获得形态学完全缓解后体内仍残存的形态学上不能检测到的少量白血病细胞。随着技术的进步,MRD检测方法呈现多样化,检测的灵敏度也不断提高[5]。MRD检测有利于更早地预测白血病的复发，指导白血病的临床治疗，根据体内白血病细胞多少以决定是继续化疗抑或停止治疗；有利于较早发现白血病细胞是否耐药，并依此指导临床选用更灵敏、更具杀伤力的治疗措施[6]；有助于评价骨髓移植后的缓解率及自体造血干细胞移植的净化效果[7]。

部分白血病通过PCR技术检测特定基因异常来检测MRD[8]。因此，PCR技术对于急性白血病MRD检测具有一定意义。但部分急性髓系白血病目前本身尚不能检测到基因异常[9]，并且对每一位初诊的急性白血病患者均要筛选出特定基因异常其成本较高。因此，建立流式细胞术检测急性白血病患者MRD的方法仍是必要的。

本研究旨在采用流式细胞术对正常骨髓髓系原始细胞和急性髓系白血病细胞免疫表型进行分析，探讨急性髓系白血病细胞异常免疫表型模式和用于MRD检测的抗体组合，建立以多色流式细胞术检测急性髓系白血病MRD的方法，并探讨其对疾病复发监测的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 实验对象为四川大学华西医院2017年6月至2018年6月就诊的患者。其中初诊时确诊为急性髓系白血病患者346例，初诊时已进行全面免疫表型分析且临床已明确急性白血病亚型，在行诱导化疗后及巩固化疗长期随访监测过程中可抽取骨髓标本进行MRD检测的患者58例，非恶性血液系统疾病患者20例。采用肝素钠抗凝真空采血管收集患者新鲜骨髓标本，按照荧光抗体试剂配套的操作说明书标记、处理、检测所需抗原。所有急性髓系白血病患者诊断、分类标准参照《WHO造血和淋巴组织肿瘤分类》(2016版)。完全缓解标准参照《血液病诊断及疗效标准》。

1.2仪器与试剂 荧光标记的单克隆抗体试剂均购自美国BD公司。除此之外还使用了BD公司穿孔素、磷酸盐缓冲液(PBS)、氯化铵溶血剂。本实验采用BD FACSCanto Ⅱ流式细胞仪、低速离心机、BD Diva流式分析软件。

1.3方法 本研究检测了20例非恶性血液系统疾病患者骨髓标本中髓系原始细胞的免疫表型(相关抗原标记包括CD2、CD5、CD7、CD13、CD15、CD19、CD33、CD34、CD38、CD117、CD56、CD14、CD64、HLA-DR)，以建立正常髓系原始细胞免疫表型模式。收集346例初诊急性髓系白血病患者骨髓标本，分析白血病细胞异常免疫表型，包括：(1)抗原跨系表达；(2)跨阶段表达；(3)过度表达及缺失表达。收集58例 MRD患者骨髓标本，分析其残留情况。对于急性髓系白血病患者，评估的抗体组合主要包括：CD15/CD13/CD33/CD34/CD45，CD56/CD117/CD38/CD34/CD45， CD7/CD117/CD19/CD34/CD45，CD2/CD117/CD5/CD45，CD64/CD117/CD14/CD34/HLA-DR/CD45。组合方式可以视初诊时免疫表型而定。对于流式细胞术MRD检测结果阳性而细胞形态学阴性的患者(尚在诱导化疗期的患者除外)，观察其后期临床缓解和复发情况。

2 结 果

2.1正常骨髓的髓系原始细胞免疫表型 在CD45/SSC散点图上，20例非恶性血液系统疾病患者骨髓标本中原始细胞区细胞主要为CD117阳性髓系原始细胞，其在有核细胞中所占比例为2.51%±0.84%，这类CD117阳性原始细胞共表达抗原阳性率如下：CD64+为11.2%±6.80%，CD7+为2.7%±3.50%，CD19+为0.11%±0.13%，CD5+为0.08%±0.09%，HLA-DR+为90.61%±8.77%，CD14+为0.09%±0.11%。还有部分原始细胞区细胞为CD34阳性髓系原始细胞，其在有核细胞中所占比例为1.21%±0.83%，这类CD34阳性原始细胞共表达抗原阳性率如下：CD13+/CD33+为72.6%±11.80%，CD13+/CD33-为22.3%±13.90%，CD56+为1.31%±1.08%，CD64+为0.16%±0.09%，HLA-DR-为0.11%±0.08%，CD15+为1.4%±0.10%，CD38+为97.2%±4.50%。

对于单核细胞，主要观察了CD13/CD33、CD14/CD64的表达，单核细胞群中CD13+/CD33+、CD14+/CD64+细胞分别占单核细胞的99.08%±1.32%和97.75%±1.71%。

2.2急性髓系白血病细胞免疫分型 本研究分析了346例急性髓系白血病的白血病细胞免疫表型[急性早幼粒细胞白血病(APL)除外]，出现异常免疫表型的有314例(占90.8%)。在本研究所涉及的抗原标志物中，跨系表达有5类，抗原表达强度变化或缺失有7类，跨阶段表达有3类。各类抗原异常表达在急性髓系白血病中出现的阳性率见表1。

表1 急性髓系白血病抗原异常表达及其阳性率

在表1中，急性髓系白血病常见异常免疫表型为CD7+/CD117+和CD34+/CD56+。其散点图见图1。以成熟淋巴细胞为参照，原始细胞分别出现在图1A和图1B的Q2象限中，为异常原始细胞，两者均为抗原跨系表达。

2.3急性髓系白血病MRD检测 研究对象中58例急性髓系白血病患者共进行了173次MRD检测，与骨髓细胞形态学分析相比较，采用χ2检验对结果进行分析，χ2=24.735，P=0.00。细胞形态学原始细胞比例>5%而流式细胞术为阴性的2次结果中，原始细胞免疫表型均无明显异常，临床亦无明显复发的证据。流式细胞术阳性结果中原始细胞比例>5%的有36次，其中2次形态学结论为阴性；原始细胞比例<5%的有41次，其中30次形态学结论为阴性。

注：红色表示髓系原始细胞；绿色表示成熟淋巴细胞。

图1急性髓系白血病常见异常免疫表型CD7+/CD117+及CD34+/CD56+

2.4临床观察 在1年观察期内，流式细胞术检测MRD阳性而细胞形态学阴性的患者复发率为69.23%(18/26)；流式细胞术及细胞形态学均为阴性的患者复发率为15.63%(5/32)，明显低于流式细胞术检测MRD阳性病例。

2.5分子生物学结果比较 在上述173次MRD检测中有73次进行了流式细胞术、PCR融合基因检测，且初诊时两者均为阳性，其中APL 22例，非APL 51例。有65例2种检测结果一致，占89.04%(65/73)，具体分析见表2。有8例两者结果不一致的情况，其中+/-组合1例为APL，-/+组合中7例均为APL。

表2 急性髓系白血病流式细胞术MRD和PCR结果患者符合例数比较(n)

3 讨 论

急性白血病恶性克隆细胞抗原的表达具有很大的异质性。急性髓系白血病的流式细胞术诊断有赖于原始细胞比例的明显增加和克隆性白血病细胞的异常免疫表型特征作为依据[10]。本实验对比分析正常骨髓髓系原始细胞和白血病细胞上的多种免疫表型，以提高对原始细胞的分辨率，并发现不同于正常细胞的肿瘤性原始细胞群，即免疫表型模式分析。

随着相关文献的报道，人们对各类抗原分子的认识也在不断更新。CD117是急性髓系白血病相对较特异的免疫标志物，在急性髓系白血病-M0/M1/M2/M4中均可表达[11]。CD34亦可作为髓系原始细胞标记，但其表达范围不及CD117广泛，主要见于早期髓系原始细胞，并需注意排除B祖细胞干扰，当患者出现耐药时CD34表达水平升高[12]。CD13、CD33、CD38在早期髓系原始细胞即可出现。CD15、CD64主要表达于较成熟的粒细胞和单核细胞，在早幼粒细胞和原幼单核细胞亦可部分表达，但在原始粒细胞中少见表达。CD14是较特异的单核细胞标志物，表达于成熟单核细胞，亦存在极少量幼稚单核细胞。CD117少量表达于幼稚单核细胞[11]，不表达于成熟单核细胞。CD7的表达范围较广，正常情况下可表达于极早期的髓系原始细胞，其表达程度随细胞发育逐渐减弱。CD56抗原是一种神经细胞黏附分子，在血液肿瘤及实体肿瘤中均可表达[13]。正常骨髓中难以见到表达CD2、CD5或CD19的髓系原始细胞。

对于本研究关注的3类抗原表达异常中，白血病性原始细胞跨系表达是较常见的一种异常免疫表型特征。急性髓系白血病常见的跨系表达是T淋巴细胞的抗原标志CD7和B淋巴细胞抗原标志CD19。CD56亦是急性髓系白血病常见的抗原标志，但其作为跨系表达的意义不及CD7和CD19，因为化疗后增生的正常原始粒细胞亦可见CD56表达。白血病细胞另一异常特征是出现原始细胞抗原和后期较成熟细胞抗原共表达。本研究中CD15是急性髓系白血病中最常见的与原始细胞抗原共表达的抗原标志。CD64、CD14与原始细胞标志共表达的发生率均较低。除此之外，白血病细胞抗原表达强度也可表现出与其发育阶段不相符合的情况。CD13、CD33、CD38、HLA-DR均可发生表达强度变化。而CD13、CD33因为在正常原始细胞亦为部分表达，故在MRD检测时可能难以明确区分少量CD13/CD33表达异常的白血病细胞和混杂的正常原始细胞。对于抗原表达强度变化的正确判断还有赖于标本处理过程的一致性和仪器状态、参数设置的稳定性。

白血病细胞异常表达的抗原不仅在初发的白血病细胞中可以检测到，而且在治疗后达到形态学完全缓解时，残存的白血病细胞多数仍保留其初发时的抗原异常表达[14]，这保证了流式细胞术检测白血病MRD的临床实用性。本研究结果显示，选择合适的免疫表型模式进行分析，可为临床急性髓系白血病病例提供较准确的MRD检测结果。流式细胞术方法与细胞形态学相比，流式细胞术MRD检测结果阳性率明显提高，且检测结果与患者临床进展相一致，流式MRD阳性者复发率较高，预后较差，被证明是儿童急性髓系白血病在诱导和巩固治疗期间复发的一个有效的独立预后指标[15]，与PCR结果符合度为89.04%，这显示流式细胞术检测结果亦具有较高的灵敏度。但APL除外，绝大多数APL有PML/RARα融合基因异常，且异常免疫表型出现率低于非APL患者，故应以PCR作为其MRD检测的首选方法。同一种抗原采用不同颜色荧光标记的检测效率可能存在差异，但因本实验室采用的抗体荧光颜色相对固定，在此没有进一步探讨。本文选取的研究对象为四川大学华西医院就诊患者，由于实验对象的局限性，需要进一步扩大样本量和研究区域来验证本文实验结果。

4 结 论

急性髓系白血病具有明显不同于正常来源原始细胞的异常免疫表型特征，适合于采用流式细胞术进行白血病MRD检测。当残留的白血病细胞>5%时，骨髓细胞形态学和流式细胞术结果吻合度高，流式细胞术可以作为前者的补充；但当残留的白血病细胞<5%时，使用流式细胞术MRD检测方法具有较高的灵敏度，在考虑患者的经济状况情况下，流式细胞术是检测MRD的重要手段。并且和分子生物学结果吻合度高(APL患者除外)，能更准确地反映体内白血病细胞负荷和病情变化，提示患者复发风险，指导临床治疗方案调整。