基于网络药理学和分子对接探究金花清感颗粒治疗新型冠状病毒肺炎的作用机制

彭文潘，徐 泳，韩 迪，冯凡超，顾 诚，王志超，周贤梅*，吕 红

1南京中医药大学附属医院，南京 210029；2太仓市中医院呼吸科，太仓 215400

2019年底，中国湖北省发生了不明原因引起的病毒性肺炎，经研究鉴定是由一种新型冠状病毒所致。随即世界卫生组织(World Health Organization，WHO)将该病命名为“2019冠状病毒疾病[1](coronavirus disease 2019，COVID-19)”；国际病毒分类委员会(The International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)将该病毒命名为“严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型[2](severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)”，可见它是SARS冠状病毒的近亲[3]。临床上COVID-19可分为轻型、普通型、重型、危重型[4]。轻型症状轻微，普通型主要表现为发热、乏力、干咳等，重者可出现气促、呼吸困难和静息状态指氧饱和度下降[5]，危重型主要表现为ARDS、脓毒症以及休克等，甚至危及生命。截至目前，针对COVID-19，仍无特异性治疗药物。抗击疫情关键时期，中医药彰显了防治COVID-19的优势，并且能够与西医治疗互补，提高治疗效果。在我国COVID-19确诊病例中，中医药使用覆盖率达91.5%，中医药总有效率达90%以上。

作为指南推荐使用的金花清感颗粒由金银花、连翘、石膏、蜜麻黄、炒苦杏仁、黄芩、浙贝母、知母、牛蒡子、青蒿、薄荷、甘草十二味中药组成。该方由麻杏石甘汤和银翘散加减化裁而来，前者是张仲景《伤寒论》用于治疗“汗出而喘、无大热”的经典方，组方包含麻黄、苦杏仁、石膏和甘草；后者是吴鞠通《温病条辨》用于治疗“但热不恶寒而渴者”的经典方，组方包含连翘、金银花、桔梗、薄荷、竹叶、鲜芦根、甘草、荆芥穗、淡豆豉和牛蒡子。金花清感颗粒十二味中药组方合理、配伍科学、寒热并用，功效为“疏风宣肺、清热解毒”，主治风热感冒或肺热感冒，以及流感。段璨等人最新临床研究发现，在123例COVID-19患者中金花清感颗粒联合常规治疗相对单纯常规治疗，患者的患者的发热、咳嗽、乏力、咳痰临床症状均有明显的缓解[6]。

网络药理学为多学科融合而成的新兴产物，运用计算机模拟、数据分析、多种数据库检索等方法，通过多重网络数据库检索分析阐明药物的物质基础及其治疗相关疾病作用机制。英国邓迪大学Andrew L.Hopkins教授2007年首次提出了网络药理学的概念，从整体角度系统地探索药物与疾病间的关联性，同年李梢提出基于生物网络调控的方剂研究模式与实践[7]，2013年李梢完善了中药网络药理学的理论、方法与应用[8]。为药物作用机制探究提供新的策略和方向，也为多成分、多靶点、多疾病的复杂中药作用机制研究提供了新的思路。该方法汇集了系统生物学、计算生物学以及网络拓扑学的知识，从整体角度阐释了药物和疾病之间的关系，这恰好与中医的整体观不谋而合。本研究拟通过网络药理学技术探讨金花清感颗粒中潜在物质基础，及其治疗COVID-19的可能作用机制，同时也为COVID-19的治疗和金花清感颗粒的深入研究提供新思路。

1 材料与方法

1.1 数据库

中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)；中药综合数据库(Traditional Chinese Medicines Integrated Database，TCMID，http://119.3.41.228:8000/tcmid/)；Similarity ensemble approach数据库(http://sea.bkslab.org，SEA)；SwissTargetPrediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch)；UniProt数据库(Universal Protein，http://www.uniprot.org/)；生物信息学资源数据库(DAVID，https://david.ncifcrf.gov/)；STRING数据库(https://string-db.org)；人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)；GeneCards数据库平台(http://www.genecards.org)。

1.2 获取药物活性成分和潜在靶点

分别以“金银花”、“石膏”、“麻黄”、“苦杏仁”、“黄芩”、“连翘”、“浙贝母”、“知母”、“牛蒡子”、“青蒿”、“薄荷”、“甘草”为关键词，通过TCMSP数据库检索各中药的活性成份，借助人体ADME/Tox预测，整合器官水平的PBPK模型计算活性成分的口服生物利用度(OB)和类药性(DL)，以OB≥30%，DL≥0.18%作为活性成分的筛选条件。将筛选的化合物导入PubChem获取对应的SMILES文件，并输入到SEA和SwissTargetPrediction数据库，综合TCMSP、SEA和SwissTargetPrediction数据库筛选结果，获取上述中药活性成分对应的潜在作用靶点。

图1 金花清感颗粒所含活性成分信息Fig.1 Information of active ingredients of Jinhua Qinggan Granules

1.3 COVID-19相关靶点获取

分别在OMIM和GeneCards Suite数据库中，以“COVID-19”为检索词，将两个数据库结果合并，去除重复，获取COVID-19相关的潜在靶点。

1.4 获取疾病和药物相交靶点

使用R语言(Version3.6.1)VennDiagram数据包，将金花清感颗粒潜在作用靶点映射到COVID-19相关靶点中，并制作韦恩图。将两者交集作为金花清感颗粒治疗COVID-19的潜在作用靶点。

1.5 构建网络图

通过运行脚本将上述信息生成三个文件，分别是节点之间的连线网络文件、节点分类文件、1.4中获得相交靶点对应的化合物文件。将上述三个文件导入Cytoscape软件制作“活性成分-靶点”网络图，并对其进行拓扑学分析。

1.6 获取PPI图

将1.4中获得的基因信息输入到STRING数据库，种属选择“Homo sapiens”，获取“蛋白-蛋白”相互作用网络图，置信度设置为0.9。并将文件“string_interactions.tsv”导入cytoscape软件进行拓扑学分析，通过介值中心度(betweenness centrality)和度值(degree)筛选核心靶点。

1.7 GO和KEGG富集分析

为了对靶基因的功能进行描述和注释，以及探究其作用的信号通路。通过DAVID数据库将1.5中筛选出来的核心靶点进行GO和KEGG富集分析，选择物种“Homo sapiens”。GO富集分析包括分析生物学功能(molecular function，MF)、生物学过程(biological process，BP)、细胞学组分(cellular components，CC)三个部。进行KEGG富集分析，筛选出金花清感颗粒治疗新冠肺炎的潜在作用信号通路。GO和KEGG富集分析均以校正P值(FDR)<0.05作为筛选条件。

1.8 分子对接

从pubchem 数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载化合物SDF结构，调用OpenBabel2.4.1转化为mol2格式，并使用AutodockTools1.5.6打开配体小分子，并加氢、加电荷、检测配体的root、进行可旋转键的搜寻与定义，并保存为pdbqt文件。ACE2、Spike protein、Mpro、RdRp蛋白三维结构由2019-nCoV药物靶标结构信息共享平台提供(http://ncovtarget.qnlm.ac/web/mg/hm)；TMPRSS6蛋白三维结构从RCSB Protein Data Bank (www.rcsb.org)下载获得，在AutodockTools1.5.6中打开，通过添加氢原子、计算Gasteiger电荷、合并非极性氢后，将其定义为受体并保存成pdbqt文件。采用Autodock vina 1.1.2进行半柔性对接，选取affinity最佳构象，作为最终的对接构象。

2 结果

2.1 金花清感颗粒活性成分和潜在靶点

通过TCMSP检索金银花、石膏、麻黄、苦杏仁、黄芩、连翘、浙贝母、知母、牛蒡子、青蒿、薄荷、甘草中符合条件化合物共有227个。其中23个来自金银花，23个来自麻黄，19个来自苦杏仁，36个来自黄芩，23个来自连翘，7个来自浙贝母，15个来自知母，8个来自牛蒡子，22个来自青蒿，10个来自薄荷，92个来自甘草；通过PubChem获得石膏的活性成分1个(图1)。26个化合物所分布的药物不止一种，如山奈酚分布于牛蒡子、麻黄、知母、金银花、青蒿、连翘、甘草7味中药中，豆甾醇分布于苦杏仁、黄芩、麻黄、青蒿、知母、金银花6味中药中，β-谷甾醇分布于牛蒡子、黄芩、麻黄、金银花、连翘、浙贝母6味中药中(表1)。12味中药共获得720个潜在靶点。

表1 重复化合物信息Table 1 Information of duplicate compound

2.2 金花清感颗粒新冠肺炎相交靶点

共获得疾病相关靶点253个，其中Genecard数据库251个，OMIM数据库2个。将疾病相关靶点映射到药物潜在靶点中，共获得79个公共靶点(图2)，靶点详细信息见表2。

2.3 “活性成分-靶点”网络图

网络图(图3)中可见共250个节点，包括活性成份169个、靶点79个、疾病和药物节点各一个；共974条相互作用的线。网络密度为0.031，网络异质性为2.314。对网络图进行拓扑学分析，其中节点连线的多少代表节点度值的高低，介值中心度大小代表节点在治疗该疾病的核心度，两者是描述节点的重要指标。在活性成分节点中介值中心度和度值均大于均值的有27个；在靶点的节点中介值中心度和度值均大于均值的有4个节点(表3)。

图2 药物和疾病靶点交集Fig.2 The intersection of drug and disease targets

表2 共有靶点信息Table 2 The information of shared targets

续表2(Continued Tab.2)

图3 “活性成分-靶点”网络图Fig.3 "Ingredient-Target" network diagram注：粉红色节点为活性成分;蓝色节点为靶点。Note:The pink node represents the active ingredient;The blue node represents the target.

表3 网络图中核心节点Table 3 Core nodes in the network diagram

续表3(Continued Tab.3)

2.4 PPI图

将79个靶点信息导入STRING数据库进行分析，物种选择“Homo sapiens”，最低置信度设置为0.9，共保留了74个节点。将生成的文件“string_interactions.tsv”导入cytoscape软件生成PPI图，通过拓扑学分析筛选出节点度值和介值中心度大于均值的靶点，并将筛选出的18个核心靶点用作后续的富集分析(图4)。

图4 PPI图节点拓扑筛选过程Fig.4 Topology selection process of target node注：A：74个节点，333条连接线；B：18个节点，84条连接线。Note:A:74 nodes,333 connecting lines;B:18 nodes,84 connecting lines.

2.5 GO和KEGG富集分析

将2.4中获取的核心靶点信息输入DAVID分析平台，物种选择“Homo sapiens”，进行在线GO和KEGG富集分析。GO富集分析共获得936个条目，FDR小于0.05的共有274个条目；其中BP共260条，CC共5条，MF共9条(图5，图中BP取FDR最小的前20条)。涉及细胞增殖、凋亡和程序性死亡的调控、以及免疫应答和白细胞分化。KEGG富集分析中，FDR小于0.05的共有35个条目(图6)。其中的Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路、MAPK信号通路、T细胞受体信号通路和病毒感染关系密切，而FDR最小的是Toll样受体信号通路(图7)。

2.6 分子对接

筛选“2.3”中度值排名前10的化合物分别与SARS-CoV-2关键蛋白进行分子对接验证，由图8可知，与Mpro对接效能最高的化合物是quercetin(MOL000098)，效能值为-7.4 kcal/mol；与ACE2和RdRp蛋白结合效能最高的均是arctiin(MOL000522)，效能值分别为-9.6 kcal/mol和-9.7kcal/mol；与Spike蛋白结合效能最高的化合物是luteolin(MOL000006)，效能值为-6.7 kcal/mol；与TMPRSS6蛋白结合效能最高的是beta-sitosterol，效能值为-7.2 kcal/mol。图9列出了上述结合模式图。

图5 GO富集分析结果Fig.5 The results of GO enrichment analysis

图6 KEGG富集分析结果Fig.6 The results of KEGG enrichment analysis

3 讨论

国际权威医学期刊《内科学年鉴》曾刊登了由王辰院士领衔、11家医院共同完成的关于奥司他韦和传统中药汤剂金花清感颗粒治疗甲型H1N1流感的多中心临床研究[9]。证实金花清感颗粒可以缩短流感病毒引起的发热时间和改善症状，从高级别的循证医学层面证实了该方的有效性，并获得中药抗甲流国家科技进步一等奖。与甲流同属流感病毒的SARS-CoV-2引起的COVID-19，其典型临床表现主要以发热、乏力、干咳为主，少数伴有鼻塞、流涕、咽痛和腹泻，重症患者多在一周以后出现呼吸困难和低氧血症，甚至危及生命。目前，针对COVID-19尚无有效治疗药物，COVID-19属于中医瘟疫病范畴，中医治疗瘟疫病不是单纯与病毒对抗，而是注重驱邪与扶正并重，攻补兼施，使邪有出路，正气得复。

通过对金花清感颗粒治疗COVID-19的网络药理学分析可知，该方的核心化合物是甘草查尔酮A、芒柄花黄素、芦荟大黄素、薯蓣皂苷元、荷包牡丹碱、紫杉碱、柚皮苷、木蝴蝶素A、黄芩甙、汉黄芩素、金合欢素、异鼠李素、槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇和β-胡萝卜素，这17个化合物中53%同时存在2味或者多味中药中。在KEGG富集分析结果中，Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路、MAPK信号通路、T细胞受体信号通路和病毒感染以及感染后的免疫关系密切。巨噬细胞对微生物的识别是由细胞膜表面的受体介导的，被称为模式识别受体(PRR)，包括各种类型的Toll样受体(TLR)[10]。病毒感染后，TLR募集下游衔接子分子，激活细胞内信号传导级联反应[11]，上调了基因转录以产生促炎分子。在炎症反应中，花生四烯酸可通过PTGS2途径代谢为前列腺素(PG)[12]。PG在炎症过程中可使血管扩张、血管通透性升高而导致组织器官水肿；促进微静脉、毛细血管释放淋巴因子；另外PG还具有致热作用，这也是大部分感染性疾病出现发热的原因，故金花清感颗粒能够缩短发热时间可能是通过PTGS2起作用的。研究表明，PTGS2与各种炎性毛细血管后微静脉的通透性、白细胞的趋化作用、T淋巴细胞产生及疾病的发生、发展有关[13]。NOD样受体(NLR)家族成员NLRC5在各种类型的感染中调节主要组织相容性复合体I类(MHC-1)，Christopher R Lupfer在动物实验发现NLRC5在抑制流感病毒复制，促进病毒清除方面起到了重要作用[14]。同时有学者发现小鼠中NLRP5，ASC或Caspase-1的遗传缺陷会导致支气管肺泡灌洗液(BALF)和血清中IL-1β和IL-18的浓度降低，减少白细胞向肺部的浸润并增加病毒滴度[15]。早在2017年已有研究表明，山奈酚通过灭活TLR-髓样分化因子88(MyD88)介导的NF-κB和MAPK信号通路消除H9N2猪流感病毒引起的急性肺损伤[16]，其中明确指出，山奈酚显著抑制TLR4、MyD88、IκBα和核因子-κB(NF-κB)p65亚基的磷酸化、MAPK的结合活性和磷酸化水平，综上可知，金花清感颗粒通过多途径多靶点的方式达到抗COVID-19目的，这与中医的整体观不谋而合。

图7 Toll样受体信号通路Fig.7 Toll-like receptor signaling pathway注：图中红色节点为金花清感颗粒的潜在作用靶点。Note:The red nodes in the figure indicate the potential targets of Jinhua Qinggan Granules.

图8 分子对接效能热图Fig.8 The heat map of molecular docking efficiency

图9 与病毒关键蛋白对接效能最高的模式图Fig.9 Pattern of the most efficient docking with the key protein of the virus

Spike蛋白含有两个亚基S1和S2，其中S1主要包含有受体结合区(RBD)，负责识别细胞的受体，使让病毒与细胞相连[17]。Stefan Pöhlmann教授研究发现在COVID-19中ACE2可以促进SARS-CoV-2进入宿主细胞[18]，同时细胞丝氨酸蛋白酶TMPRSS2和内体组织蛋白酶CatB/L能够协同激活SARS-2-S入侵细胞，而蛋白酶TMPRSS2的作用更为关键。RdRp(也称为nsp12)能够催化病毒RNA的合成，是冠状病毒复制/转录机制的关键组成部分，以RNA聚合酶为核心，病毒会利用其它辅助因子(如nsp7、nsp8等)进行自我复制[19]。Mpro是一种高度保守的、在冠状病毒复制过程中必不可少的蛋白酶，是开发广谱抗病毒药物的一个有希望的靶点[20]。上述五个关键蛋白涉及了病毒与靶细胞的结合、侵入靶细胞、病毒RNA的复制和病毒封装，通过分子对接的验证，发现金花清感颗粒对SARS-CoV-2从感染到致病的所有关键环节靶点都有较高的结合能，从侧面印证了该方的有效性。

COVID-19疫情给全球的经济带来了一定的影响，也给全世界的疫情防控工作带来了巨大的挑战和压力。在医务工作者的共同努力下，我国疫情已得到明显控制。目前，研发可用于抗COVID-19药物已经成为广大医药科研工作者的重要任务。国内外多家科研机构开展药物研发主要分为两个方向。第一，疫苗研发；第二，特效药物，主要为中和抗体的研发。虽已有近百项与COVID-19相关的临床试验在国家临床试验注册中心注册，但截至目前，仍未有特效治疗药物，同时疫苗的研发又有其滞后性。因此本研究将重点转向指南推荐使用且已被列为非处方药的金华清感颗粒，在王辰院士研究结果的基础上，利用网络药理学技术对金花清感颗粒治疗COVID-19的潜在物质基础进行了初步研究，发现金花清感颗粒主要通过Toll样受体信号通路等，作用于PTGS2、TNF-α、NF-κB、IL-6和CASP8等多途径，多靶点的方式发挥抗COVID-19作用，为金花清感颗粒的深入研究和防治COVID-19的药物筛选奠定了基础。

中医药对于COVID-19的治疗起到了重要作用，在湖北确诊病例救治中，传统中医药参与度在70%以上，全国其他地区更是高达90%以上。本研究主要是通过查阅已有药材成分从而进行相关分析，并筛选出了差异性最大的几条信号通路。但是本研究仅通过现有数据库和相关软件筛选金花清感颗粒的有效成分和靶点，未考虑药物产地、炮制、中药剂量等因素，故本研究存在一定的局限性，本研究的结果尚待进一步基础实验验证。