CB 微核法人体外周血淋巴细胞检测在全自动微核扫描分析系统上的应用

陈 洋 邱海源 朱晓颖 马 冲 戴世尧

（广东省惠州市职业病防治院 广东惠州 516001）

1 前言

阻断微核法（CB 微核法）是在细胞进入第一次有丝分裂前，向培养液中加入能阻断胞质分裂但不影响细胞核分裂的胞质分裂剂—松胞素-B（Cyt-B）的方法，Cyt-B 可以使细胞有丝分裂为特殊形态的双核细胞，未发生细胞核分裂的细胞则会维持单核细胞形态。

通过检测致突变因素作用后的双核细胞的微核细胞率和双核细胞微核率，可同时获得致突变因素对细胞的遗传毒性损害和对细胞周期的影响[1-6]。 本文分析了CB 微核法试验在全自动微核扫描分析系统上的应用。

2 材料与方法

2.1 对象

近期无明显用于诊断和治疗的医疗照射史和化学接触史，不吸烟25 岁健康男性志愿者5 名。

2.2 材料与设备

材料：注射用环磷酰胺：用规格为0.2 g 的生理盐水配成20 mg/mL，置于冰箱4℃保存；Cyt-B：先溶于二甲基亚砜（DMSO）中，于-20℃保存，用前融化，用生理盐水稀释成300 μg/mL；固定液：甲醇∶乙酸=3∶1。

设备：RPMI 1640 培养基；MetaSystems 图像分析系统；AXIO Imager Z2 扫描系统；生物显微镜。

2.3 CB 法微核试验样本的制备

取0.5 mL 静脉血中加入4 mL 经不同浓度环磷酰胺处理过的RPMI 1640 培养基中，混匀，37℃恒温培养40 h 加300 μg/mL Cyt-B，终浓度为6 μg/mL，继续培养至70 h 后终止培养。将培养基倒入15 mL 尖底离心管中，1 200 r/min 离心7 min，吸去上清液加入4 mL 0.075 mol/L 氯化钾低渗溶液，混匀静置1 min后加入1 mL 固定液，1 200 r/min 离心7 min，去上清液后加入固定液8 mL，混匀静置20 min，1 200 r/min离心7 min，去上清液后再次加入5 mL 固定液固定20 min，1 200 r/min 离心7 min，去上清液，余下0.5 mL混匀制成细胞悬液，滴片，气干，Giemsa 染色。 观察到的细胞大部分即为处于第一次有丝分裂时期的双核淋巴细胞。

2.4 常规培养法微核试验的样本制备

取0.5 mL 静脉血中加入4 mL 经不同浓度环磷酰胺处理过的RPMI 1640 培养基中，混匀，37℃恒温培养72 h 后终止培养。将培养基倒入15 mL 尖底离心管中，1 200 r/min 离心7 min，吸去上清液加入4mL 0.075 mol/L 氯化钾低渗溶液， 混匀静置1 min 后加入1 mL 固定液，1 200 r/min 离心7 min， 去上清液后加入固定液8 mL， 混匀静置20 min，1 200 r/min 离心7 min，去上清液后再次加入5 mL 固定液固定20 min，1 200 r/min 离心7 min，去上清液，余下0.5 mL混匀制成细胞悬液，滴片，气干，Giemsa 与瑞氏染液2∶1 比例混合，染色。

3 结果

样本经AXIO Imager Z2 扫描系统和MetaSystems图像分析系统扫描后，分析双核细胞数和疑似阳性双核细胞，检测人员根据识别标准去除假阳性双核细胞，并在阳性双核细胞中识别微核的数量做好记录。样本经由检测人员显微镜镜下盲法阅片，只观察双核细胞，识别其中的阳性双核细胞数及微核个数并做好记录。 双核细胞的识别标准：（1）双核细胞具有2 个独立且核膜完整的细胞核，若细胞坏死、凋亡或细胞中为单核、3 或3 以上个多核均应舍弃。（2）同一细胞中的双核大小接近、色度深浅相同。 （3）如果双核之间有1 个或多个核质桥连接，桥宽不应宽于其核直径的1/4。 （4）理想的双核边界可以相连，但不应该交叠，若交叠必须能识别各自的界限。（5）1 个双核细胞胞质与临近细胞的胞质之间的界限要清楚。微核的识别标准：（1）微核存在于完整的胞浆中，为圆形或椭圆形，边缘光滑。 （2）直径小于主核直径的1/3。（3）微核没有折光性。（4）微核与主核完全分开，若有相交或相切则应该看到各自的核膜。 （5）微核的结构与主核相同，嗜色性与主核一致或略浅[7，8]。其中以成熟的检测人员人工盲法阅片得到的微核细胞率及微核率的数据作为近似真实值，计算误差，允许误差为20%。 对于得到的数据进行统计学分析，因细胞遗传学中微核细胞率符合二项分布，当n 逐渐增大时二项分布就渐渐接近于正态分布。 微核率符合泊松分布，x 逐渐增大的时，泊松分布逐渐接近于正态分布[9-11]，详见表1。

表1 CB 微核法试验自动识别与人工盲法阅片结果

4 讨论

本试验中，将CB 法微核试验应用在自动分析系统上，通过自动分析系统扫描样片获得图像，复核结果快速准确，解决了检测人员用眼过度，实验室差异以及操作人员个人识别的差异问题。 应用AXIO Imager Z2 扫描系统和MetaSystems 图像分析系统扫描样片，对收获细胞后的制片过程要求比较高，为确保制片背景的清晰，固定液选择甲醇与乙酸，比例为3∶1，现用现配。制备的细胞悬液浓度不要太高，滴片时每张玻片上细胞数目不能过多，细胞间要分散良好，彼此不能重叠。 染液着色要尽可能浅，这样扫描的图片才有层次感，易于观察及识别微核。 从CB法微核试验的自动化检测中可以发现，相比微核试验的常规培养法及直接涂片法，对照组（即培养基中无添加环磷酰胺）观察到的微核细胞率及微核率明显高于两者的其他实验室正常值范围[13]。 AXIO Imager Z2 扫描系统和MetaSystems 图像分析系统与人工盲法阅片观察到的微核细胞率及微核率的比较结果说明，人工盲法阅片观察到的微核细胞率及微核率略高于AXIO Imager Z2 扫描系统和MetaSystems 图像分析系统上最后得出的数据，分析可能存在的原因是双核细胞中的微核与主核相叠加或相切时，AXIO Imager Z2 扫描系统和MetaSystems 图像分析系统是无法捕捉到的。双核细胞的判断上也存在误差，在观察的过程中发现AXIO Imager Z2 扫描系统和MetaSystems 图像分析系统对于出现核质桥情况的判断并不准确。 本实验室对于观察到的数据进行统计学分析，检测出的各组微核细胞率符合二项分布，微核率符合泊松分布。

CB 微核法试验因为是选择处于第一个细胞周期的双核细胞，所以能够尽可能的捕捉到产生的微核，因而更接近损伤的真实情况，所以CB 微核法试验的准确性是优于其他方法的微核试验的。