食品中志贺菌检测能力分析

夏恩庆

（辽宁省锦州市义县疾病预防控制中心 辽宁锦州 121100）

1 前言

志贺菌发现于1896 年，具有高致病性，不仅关系到国内日常食品和进出口食材的安全，更关系到国民健康[1]，在这种背景下国家卫计委适时修订并颁布了GB 4789.5—2012《食品安全国家标准 食品微生物学检验 志贺氏菌检验》[2]。 随着我国食品检验检疫试验技术能力的发展和提升[3]，志贺菌的检测鉴定技术不再是科学难题，本次试验为了保证实验室试验结果的正确性，确保数据的针对性，做了大量研究。

2 材料与方法

2.1 材料与仪器

材料：志贺菌样品（山东省出入境检验检疫局）；福氏志贺菌（山西安琪微生物技术有限责任公司）；麦康凯（MAC）琼脂、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐（XLD）琼脂、志贺菌增菌肉汤-新生霉素、志贺菌诊断血清（江天润生物药业有限公司）。

仪器：生物安全柜（BSCb1500HA2bX，济南鑫贝西生物技术有限公司）；智能厌氧系统（Anoxob mat Mark U，荷兰MART 微生物公司）。

2.2 方法

准备样品：冻干粉样品1（含有待测菌志贺菌的可能性），送达后立即放在2℃～6℃实验室冰箱中保存。打开样品包立即（1 min 内）加入少量（2～4 mL）磷酸缓冲液稀释液或者生理盐水稀释液，进行水化和再融化，合计40 mL 稀释液放入无菌瓶中，然后反复清洗瓶内壁，最后回收清洗液，此溶液即待测样品原液，整个过程时间控制在15～20 min 内，具体过程详见图1。

图1 样品准备流程图

3 检验方法及结果

依据GB 4789.5—2012 标准进行检验检测，同时利用标准菌株作对照[4]。

3.1 增菌试验

具体操作方法如下：取原液24 mL 进行无菌操作，取灭菌后的226 mL 志贺菌增菌肉汤，振荡后摇匀，厌氧培养16～20 h，分离并观察增菌，划线接种琼脂平板和志贺菌培养基平板，在（36±1）℃下培养20～24 h，观察平板菌落形态，增菌结果详见表1。

表1 增菌结果

3.2 初步生化鉴定

从MAC 琼脂平板中挑取A 菌和B 菌， 从XLD琼脂平板中选取C 菌和D 菌[5]，从显色培养基上选取标准菌株，4 种菌类分别接种于三糖铁琼脂、半固体琼脂和营养琼脂，置于（35±1）℃条件下培养20～24 h，分别观察结果，详见表2。

3.3 生化试验及结果

生化试验用结果详见表3。 志贺菌属、不活泼大肠埃希菌和A～D 菌详见表4。 通过生化试验结果比较4 种菌类的生化反应，最后结果显示均不符合志贺菌属的生化特征[6]。 需要说明的是，由于部分志贺菌需培养48～72 h，发育迟缓，靛基质可延迟至48 h。

3.4 血清学鉴定

挑取一环待测菌，选取2 个1 cm×2 cm 的玻片区域，各放一半待测菌环于玻片上，再用无菌接种环将区域内的菌落研成乳状液，在右边区域加1 滴志贺菌（4 种多价）属诊断血清，在左边区域加入1 滴生理盐水作为对照。 标准菌株发生凝集反应，为阳性。将玻片倾斜摇动混合观察A、B、C、D 菌均没有发生凝集反应，为阴性，详见表5。

表2 初步生化鉴定结果

表3 可疑志贺菌菌落的生化试验结果

表4 志贺菌属和不活泼大肠埃希菌、A～D 菌的生化特性区别

表5 血清学鉴定试验及其附加试验结果

4 讨论

结果表明，样品中未检出志贺菌。通过此次能力验证，辽宁省锦州市义县疾病预防控制中心实验室的检测能力得到了极大地提高，同时积累了大量的相关经验。 试验中也发现了许多不足之处：（1）通过志贺菌检测能力验证，发现棉子糖和靛基质生化反应不明显[7]。 试验人员通过与其他实验室交流，发现很多地方都发生过类似现象，因此决定在今后的试验中使用API 试纸条。 API 试纸条虽然价格昂贵但是其稳定、方便，可以进行非常标准化的微量鉴定生化管的生化试验，已经成为我国检测检疫界公认的微生物生化鉴定标准用纸和判定依据。 （2）本次试验配备志贺菌属多价血清，虽然没有血清学分型，但结合生化反应结果同时配齐了各群的多价血清，更能增加本次试验检测的可信度。 （3）本次试验过程中没有做氧化酶试验和革兰染色检查，但是其作为筛査指标，可以增加试验结果的确定性。