化妆品中金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌检测能力验证实施研究

朱旭

（吉林省药品安全监测中心 吉林长春 130062）

1 前言

随着人们生活水平的不断提高，化妆品逐渐成为人们的必备用品。研究表明，运输储存不当均有可能导致化妆品遭受细菌污染，人体使用被细菌污染的化妆品后，可能引发化脓性炎症[1]。 积极检测化妆品中的金黄色葡萄球菌与铜绿假单胞菌，具有重要意义。 本次研究以吉林省药品安全监测中心实验室CNAS T0710 化妆品为样品，采用3 种菌种鉴定方法检测化妆品中细菌种类验证吉林省药品安全监测中心实验室对化妆品中金黄色葡萄球菌与铜绿假单胞菌检测能力。

2 仪器与试剂

2.1 仪器

BSC-1100Ⅱ生物安全柜、SPX-150 生物培养箱、BKQ-B100 高压蒸汽灭菌锅、Lepgen-96 PCR 扩增仪（山东博科公司）；全自动微生物鉴定及药敏分析系统（美国赛默飞世尔公司）；基因指纹图谱鉴定系统（美国杜邦公司）。

2.2 样品与试剂

样品：选取CNAS T0710 化妆品作为化妆品能力验证样品，样品编号为A～D。

试剂：SCDLP 液体培养基（广东环凯微生物公司）；Baird-Parker（B-P）平板培养基（沈阳西陇化工有限公司）；血琼脂平板培养基（青岛日水生物技术有限公司）；大豆酪蛋白白琼脂（TSA）平板培养基、十六烷基三甲基溴化铵平板（青岛海博生物公司）；DNA 提取试剂盒、聚合酶链式反应（PCR）试剂（广州吉赛生物公司）。

3 检测方法

检测中各个步骤均严格按照操作标准（样品检测除外），另做阳性对照1（金黄色葡萄球菌）和阳性对照2（铜绿假单胞菌）。

3.1 增菌

少量吸取SCDLP 液体培养基样品置玻璃管，待玻璃管内粉末完全溶解后，将其全部移至规格为90mL SCDLP 液体培养基，在36℃下培养24 h。

3.2 选择性分离

于SCDLP 液体培养基薄膜处取培养物，在十六烷基三甲基溴化铵平板上行划线接种，轻摇样品混合液，各取1 环增菌液在B-P 平板和血琼脂平板上行划线接种，36℃下培养24 h。

3.3 生化反应试验

在B-P 平板上寻找特征典型菌落，取菌划线接种于血琼脂平板和TSA 平板，36℃下培养24 h 后，涂片进行革兰染色和镜检，并行甘露醇发酵与血浆凝固酶试验。 在十六烷基三甲基溴化铵平板上寻找特征典型菌落，取菌划线接种于TSA 平板，36℃下培养24 h 后，涂片进行革兰染色和镜检，并进行氧化酶、绿脓菌素、硝酸盐还原产气、明胶液化及42℃生长试验。

3.4 菌种鉴定

3.4.1 全自动微生物生化鉴定

于TSA 平板取单个菌落，采用全自动微生物生化鉴定系统自动鉴定菌种。

3.4.2 基因测序鉴定

参照操作要求采用DNA 提取试剂盒提取DNA，在16SrRNA 通用引物下对细菌16SrRNA 基因序列行PCR 扩增。 PCR 体系包括细菌基因组DNA2 μL，PCR 反应混合物20 μL，正反向引物各1 μL，采用蒸馏水将体积增至40 μL。 PCR 反应条件：于100℃下热盖，95℃下持续变性3 min、变性30 s，55℃下退火30 s，72℃下延伸1 min，此过程循环35 次后，72℃下延伸5 min，4℃下保存。

3.4.3 基因指纹图谱鉴定

选取1～3 个新鲜菌落至50 μL 样品缓冲液，充分混合，吸取30 μL 灭活，分别加入裂解液A、B 各5 μL，置于鉴定系统样品孔中开始鉴定。

4 结果

生化反应试验结果，详见表1、表2。3 种菌种鉴定方法检测相似率，详见表3。

表1 革兰阳性生化反应试验结果

表2 革兰阴性生化反应试验结果

表3 3 种菌种鉴定方法检测相似率

5 讨论

金黄色葡萄球菌属革兰阳性菌，对人体具有极强致病力，轻则引发局部化脓性炎症，重则引发败血症；铜绿假单胞菌属革兰阴性菌，同样对人体具有致病力，引起伤口化脓、败血症及其他严重心脏疾病[2]。我国卫生部于2007 年颁布《化妆品卫生规范》将金黄色葡萄球菌与铜绿假单胞菌均列入化妆品的常规检测内容，并严格要求化妆品中不得检出以上2 种细菌，化妆品细菌检测目前已成为各类型检测机构的重点工作内容[3]。 能力验证作为评测实验室检测能力的主要手段，检测人员、检测设备、检测材料、检测方法、检测环境等因素均可对能力验证造成影响，积极有效控制各方面因素，提高检测人员理论储备与操作水平，提升检测设备性能，保证检验材料质量，严格参照不同检测方法的操作标准，加强检测环境卫生管理，才能确保获得高质量检测结果[4]。 通过对参与能力验证的实验室进行研究分析，导致其检测结果不满意的原因可能有以下3 点：（1）检测过程中，样品受到污染，可能是样品保存不当所致或样品相互污染所致。 （2）部分实验室检测手段较少，如果只通过1 种分离平板行细菌鉴定，易导致平板上出现形态不典型的菌落，进而导致发生菌种鉴定错误。 （3）操作技术不熟练也可能是导致菌种鉴定错误的常见原因，例如革兰染色过程中需要严格把控各个步骤的时间，如果超出时间，则可导致细菌呈现假阴性，从而影响鉴定结果[5]。

综上所述，吉林省药品安全监测中心实验室化妆品中金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌检测能力较好，积极控制检测能力影响因素，可促进实验室检测能力提升。