茶轮斑病致病病原菌的鉴定

张 欣，卢声洁，程宇豪，王坤英，张金峰，周玉锋*

(1.贵州省农业科学院 生物技术研究所，贵州 贵阳 550006； 2.贵州大学 茶学院，贵州 贵阳 550025； 3.贵州省农业科学院 茶叶研究所，贵州 贵阳 550006)

茶树〔Camelliasinensis(L.) O. Ktze.〕是山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia)多年生灌木或乔木植物，广泛分布于热带和亚热带地区。茶树主要的经济价值在于茶叶，其含有丰富的茶多酚、茶氨酸、茶色素和茶多糖等生物活性物质，对调节人体代谢[1]、降血糖[2]、防癌抗癌[3]、抗氧化及增强免疫力[4]具有重要作用。为助力乡村振兴，打赢脱贫攻坚总决战，贵州大力发展茶产业[5]。据统计，截止2019年底，贵州茶园面积已达46.56万hm2，位居全国第二。随着茶树种植面积不断扩大，茶树病害发生呈逐年上升趋势。

近年来，我国对茶轮斑病病原菌鉴定有陆续报道，发现引起该病的病原菌具有多样性。CHEN等[6]研究发现，重庆茶区茶轮斑病病原为P.chamaeropis；WANG等[7]分离出P.chamaeropis、P.kenyana、P.rhodomytus、P.sichuanenbsis及P.camelliae等病原菌均能引起茶轮斑病。茶轮斑病是一种主要危害成叶和老叶，在嫩叶和叶梢也常有发生的严重影响茶叶产量和质量的病害[10-11]，在高温高湿等气候影响下，茶轮斑病容易大面积发生[8-11]。对于该病的防控，主要采取化学药剂和拮抗菌的防治方法。郭世保等[12]通过室内药剂筛选发现，药剂阿米西达和世高对茶轮斑病具有较好的田间防控效果；洪永聪等[13]研究发现，芽孢杆菌(Bacillussp.)可抑制茶轮斑病病原菌的菌丝生长和孢子萌发。

2020年7月，笔者在贵州省铜仁市石阡县进行田间调查时发现茶树上一种叶片病害，该病害主要表现为在成叶和老叶上常形成同心轮纹病斑，黄褐色，轮纹中央散生黑色圆形颗粒。为明确该病的病原菌并为其防控提供参考，采用单孢分离法从病叶上分离、纯化病原菌，结合形态学和分子生物学方法对其进行鉴定及致病性测试。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 茶树病害标本 2020年7月采自贵州省铜仁市石阡县五德镇长兴村茶场。标本置于信封，贴上标签(注明采集时间、地点、经纬度、采集人等)后密封，带回实验室进行分离鉴定。

1.1.2 试剂 马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基，燕麦琼脂(OA)培养基，灭菌后备用[14]；Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)；引物ITS4(5’-TCCTCCGCTT

ATTGATATGC-3’)和ITS5(5’-GGAAGTAAAA

GTCGTAACAAGG-3’)[15]，EF1-526F(5’-GTCGT

YGTYATYGGHCAYGT-3’)和EF1-1567R(5’-ACHGTRCCRATACCACCRATCT T-3’)[16-17]，BT2A(5’-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3’)和BT2B(5’-ACCCTCAGTGTA GTGACCC TTGGC-3’)[17-18]，均由重庆擎科生物技术有限公司合成。

1.1.3 仪器设备 GL100DP立式自动压力蒸汽灭菌锅，致徽(厦门)仪器有限公司；SJ-CJ-2FD双人单面超净工作台，苏洁医疗机械(苏州)有限公司；BSP-250生化培养箱，上海博讯实业有限公司；LEICA DM4B光学显微镜，北京瑞科中仪科技有限公司；T100 Thermal Cycling PCR 仪，BIORED；WGL-65B电热鼓风干燥箱，天津泰斯特仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离纯化 采用单孢分离法对病原菌进行分离[19]；将菌丝接种至PDA培养基中进行菌丝纯化。研究标本及分离所得菌株均保存于贵州省农业科学院生物技术研究所。

1.2.2 致病性测定 对分离的菌株SQ-20-1采用针刺法进行致病性测定。菌株在PDA培养基培养14 d后，用直径6 mm的打孔器在菌落边缘打取菌饼回接至刺伤的福鼎大白茶叶片上，菌丝面接触叶片，外盖一层无菌水浸泡的无菌脱脂棉用以保湿。以接种无菌PDA培养基作空白对照。将接种后的叶片置于25℃光照培养箱内进行培养，3 d后去掉菌饼和无菌脱脂棉并记录发病情况。每个处理3次重复。

1.2.3 形态学观察 将供试菌株转接至PDA和OA培养基中，于25℃恒温培养箱培养7 d，待菌落产孢后，制作合格玻片放于光学显微镜观察分生孢子梗及产孢细胞等的形态结构。测量30个产孢细胞及40～50个分生孢子的大小并取平均值。

1.2.4 DNA的提取与PCR扩增及测序 先用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取病原菌的DNA。然后采用ITS4/ITS5、EF1-526F/EF1-1567R和BT2A/BT2B进行PCR扩增。1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度。最后送样至重庆擎科生物技术有限公司进行DNA测序。

1.2.5 多基因系统学分析 用Bioedit检测和拼接基因序列，拼接后的序列上传至美国国立生物技术信息中心(NCBI)进行比对，确定其属的划分。从GenBank中下载相关序列(表1)，用Bioedit 7.0.9.0和ClustalX 1.81将序列进行对齐(Alignment)以及必要的手工比对[20-21]。采用最大简约法(Maximum Parsimony，MP)[22]和最大似然法 (Maximum Likelihood，ML)[23]联合ITS、β-tubulin和tef1的扩增基因片段进行系统发育分析。

表1 用于构建系统进化树的菌株及 GenBank 登录号

续表1

2 结果与分析

2.1 病原菌形态学鉴定

田间调查发现，该病害主要危害茶树的成叶和老叶。从图1看出，该病原菌多由叶缘或叶尖开始侵染，病斑初期呈黄褐色小斑，后渐扩展成圆形或椭圆形褐色病斑，病斑中央隆起并产生轮纹，灰白色至褐色，沿轮纹产生黑色圆形小颗粒。病原菌在25℃下培养7 d，菌落直径达8 cm；菌落初期毛绒状/絮状，白色，背面白色至淡黄色。菌落中央散生黑色、圆形分生孢子盘，其上产生墨汁滴状黏液。产孢细胞呈棍棒状，透明，大小为(10.4～18.3) μm×(1.2～4.2) μm。分生孢子由5个细胞组成，大小(18.5～25.0) μm×(4.5～6.2) μm，梭形或纺锤形，两端细胞无色，倒锥形，中间3个细胞浅褐色至暗褐色，13.1～17.5 μm；分生孢子具4隔膜，分隔处稍缢缩，颜色亦深；分生孢子顶端着生2～3根附着丝，长9.0～17.8 μm，基部着生1根附着丝，长3.8～14.0 μm。根据以上形态学特征，鉴定该菌为拟盘多毛孢属真菌(P.trachicarpicola)。

2.2 致病性测定

从图2看出，将分离所得菌株SQ-20-1直径6 mm的菌饼回接至刺伤的茶叶片上，3 d后可见明显黑褐色病斑，随后病斑扩大，7 d后病斑处产生分生孢子盘。刺伤接种PDA培养基饼的对照叶片在 7 d后仅出现机械损伤。将发病的茶树叶片进行病原菌再分离，获得的分离菌株与原病原菌株形态特征一致。因此，根据柯赫式法则可以确定，供试菌株SQ-20-1是引起茶轮斑病的病原菌。

2.3 分子生物学鉴定

对分离所得菌株SQ-20-1的DNA的ITS、tef1及β-tubulin序列进行PCR扩增和测序，获得长度分别为526 bp、552 bp和460 bp的片段。利用NCBI中BLAST进行同源性比对，菌株SQ-20-1与P.trachiaarpicola具有较高同源性，二者ITS、tef1、β-tubulin序列的同源性分别达99.8%、100%

和100%。联合ITS、β-tubulin及tef1共3个基因片段构建最大简约/最大似然树形图(图3)，供试菌株SQ-20-1与P.trachicarpicola(菌株号OP068、MFLUCC 12-0264、MFLUCC 12-0265、MFLUCC 12-0267)聚集为1支，自举支持率高达66/97。因此，结合形态学和分子生物学特征，确定菌株SQ-20-1为棕榈拟盘多毛孢(P.trachicarpicola)。

3 结论与讨论

拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)是一种常见且分布广泛的植物病原菌，可引起多种植物病害，如小孢拟盘多毛孢(P.microspora)可引起核桃、白术叶枯病[24-25]；P.Neglecta引起樟子松针黑斑病[26]；棒形孢拟盘多毛孢(P.clavispora)可引起蓝莓叶斑病[27]；茶拟盘多毛孢(P.theae)可引起茶轮斑病[28]；棕榈拟盘多毛孢(P.trachicarpicola)可引起葡萄枝干病害和果实软腐病[29]。对于拟盘多毛孢属的分类地位，在传统的分类鉴定中，仅依据形态特征和ITS单基因序列对其分析鉴定[30]。MAHARACHCHIKUMBUR等[31]研究发现，ITS基因无法很好地区分拟盘多毛孢属内的近似及其亲源种，联合ITS、β-tubulin和tef1基因可有效区分属内种的亲源关系；联合此3个基因构建系统发育树，对拟盘多毛孢属的分类地位进行修订，并从此属内划分出新拟盘多毛孢属和假拟盘多毛孢属真菌。

该研究通过单孢分离、菌株纯化及致病性试验，结合形态学分析及联合ITS、β-tubulin和tef1基因的分子生物学分析确定，从茶树病斑处分离得到的菌株为棕榈拟盘多毛孢(P.trachicarpicola)，且其是引起茶轮斑病的病原菌。