枯草芽孢杆菌Czk1与化学杀菌剂复配对橡胶树炭疽病菌的抑菌活性

谢立 贺春萍 梁艳琼 李锐 巩佳莉 翟纯鑫 吴伟怀 易克贤

摘要：【目的】探究枯草芽孢杆菌与化学杀菌剂协同防治橡胶炭疽病的可行性，构建由生防菌与化学杀菌剂组成的菌药复配剂，为橡胶炭疽病的可持续防治提供科学依据。【方法】以6种化学杀菌剂（咪鲜胺、百菌清、根康、嘧霉胺、丙环唑和嘧菌酯）及2株菌株（枯草芽孢杆菌Czk1和橡胶胶孢炭疽菌RC178）为试验材料，采用菌丝生长速率法测定6种化学杀菌剂对RC178的室内毒力，稀释平板涂布法测定6种杀菌剂与Czk1的相容性，抑菌圈法测定Czk1对RC178的室内毒力，Horsfall法明确菌药的复配方案。【结果】室内毒力测定研究结果显示，6种杀菌剂中咪鲜胺对RC178的抑菌效果最好，其有效抑制中浓度（EC50）仅为0.0778 μg/mL，其次为百菌清和根康，EC50分别为0.4694和0.4733 μg/mL。化学杀菌剂与Czk1的相容性测定结果表明，嘧霉胺、嘧菌酯、丙环唑、根康和咪鲜胺与Czk1的相容性均较好，其中根康在中高浓度下还能促进Czk1菌落数量的增长。将浓度为4.75×107 CFU/mL的Czk1分别与浓度为10.4733 μg/mL的根康和浓度为0.0778 μg/mL的咪鲜胺混配，Czk1∶根康=7∶3（v/v）时对RC178抑制的增效作用最强，增效比率（IR）为1.36;Czk1∶咪鲜胺=8∶2（v/v）时对RC178抑制的增效作用最强，IR为1.65。【结论】枯草芽孢杆菌Czk1与咪鲜胺和根康具有较好的相容性，Czk1发酵液分别与咪鲜胺和根康复配对橡胶炭疽病菌RC178的抑菌活性具有明顯增效作用，具有开发成菌药制剂的潜力。

关键词： 枯草芽孢杆菌;橡胶炭疽病;化学杀菌剂;协同防治

中图分类号： S476;S435.76                        文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2020）10-2480-08

Antimicrobial activity of Bacillus subtilis Czk1 compounded with chemical fungicides against Colletotrichum gloeosporioides

XIE Li1，2， HE Chun-ping1*， LIANG Yan-qiong1， LI Rui1，  GONG Jia-li3，

ZHAI Chun-xin3， WU Wei-huai1，YI Ke-xian1

（1Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Grops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical Agricultural Pests， Haikou  571101， China; 2Institute of Forestry， Hainan University，Haikou  570228， China; 3China College of Plant Protection， Nanjing Agricultural University， Nanjing  210095， China）

Abstract：【Objective】To explore the feasibility of synergistic control of rubber anthracnose by Bacillus subtilis and chemical fungicides， and construct a bacteria-fungicide compound composed of bio-control bacteria and chemical fungicides to provide a basis for the sustainable control of rubber anthracnose. 【Method】Six chemical fungicides， prochloraz， chlorothalonil， Genkang， pyrimethanil， propiconazole and azoxystrobin， and two strains of B. subtilis Czk1 and Colletotrichum gloeosporioides RC178 were used as test materials. The hypha growth rate method was used to determine the indoor toxicity of six chemical fungicides to RC178， the dilution plate coating method was used to determine the compatibility of six fungicides with Czk1， the inhibition zone method was used to determine the indoor toxicity of Czk1 to RC178， Horsfall method to clarify the compound plan of bacteria and medicine. 【Result】The results of laboratory toxicity testing showed that prochloraz had the best antibacterial effect on RC178 among the six fungicides， with an median effect concentration（EC50） of only 0.0778 μg/mL， followed by chlorothalonil and Genkang with EC50 of 0.4694 and 0.4733 μg/mL.Compatibility test results of chemical fungicides and Czk1 showed that pyrimethanil， azoxystrobin， propiconazole， Gen-kang and prochloraz had good compatibility with Czk1. Genkang at medium to high concentrations promoted the growth of the number of Czk1 colonies. Mixing Czk1 at  concentration of 4.75×107 CFU/mL with Genkang at concentration of 10.4733 and mixing 4.75×107 CFU/mL ber of Czk1 and prochloraz at 0.0778 μg/mL. When Czk1∶Genkang=7∶3（v/v）， the synergistic effect on the inhibition of RC178 was the strongest， the synergistic ratio（IR） was 1.36; when Czk1∶prochlorazide=8∶2（v/v）， the synergistic effect on the inhibition of RC178 was the highest， and IR was 1.65. 【Conclusion】B. subtilis Czk1 has good compatibility with prochloraz and Genkang. Czk1 fermentation liquor with prochloraz and with Genkang have obvious synergistic effect on the antibacterial activity of C. gloeosporioides RC178， which have the potential to develop a bacterial medicine preparation potential.

Key words： Bacillus subtilis; rubber anthracnose; chemical fungicide; synergistic control

Foundation item： National Key Research and Development Program of China（2018YFD0201100）; National Natural Rubber Industry Technical System Construction Special Project（CARS-33-BC1）

0 引言

【研究意义】橡胶树炭疽病主要由胶孢炭疽菌（Colletortrichum gloeosporioides Penz. Sace）和尖孢炭疽菌（C. acutatum Simmons）引起，是橡胶树上的一种主要叶部病害（李继锋，2010）。橡胶炭疽病在世界各植胶区普遍发生（Zheng，2007），1906年在斯里蘭卡首次报道。我国于1962年在海南大丰农场开割胶树上首次发现该病，其造成胶树整年落叶而不能割胶，经济损失严重（王绍春和冯淑芬，2001）。橡胶炭疽病菌侵染可引起橡胶树叶片脱落、嫩梢回枯和果实腐烂，对橡胶的质量和产量带来严重影响，造成重大的经济损失。现阶段对该病害的防治仍以化学防治为主，农业防治为辅。长期使用化学药剂防治会引起病菌抗药性及环境污染等问题，农业防治只是在胶树越冬期至抽芽初期及在病害流行末期通过施用硫酸铵速效肥以促进胶树快速恢复生长，从而提高其抗病能力（古鑫，2012），但长期施用化肥会导致土壤肥力下降，生产成本增加，环境污染和橡胶品质下降等。因此，筛选防治橡胶炭疽病的高效低毒杀菌剂，开展生物—化学协同防治研究，对橡胶炭疽病的可持续防治具有重要意义。【前人研究进展】目前，国内外针对橡胶炭疽病的研究主要集中在橡胶炭疽病菌生物学特性、侵染特征（冯淑芬等，1998;崔昌华，2006;Liu et al.，2018），以及杀菌剂对橡胶炭疽病菌的毒力测定和杀菌剂筛选试验方面，利用化学防治橡胶炭疽病的方法主要有化学杀菌剂、烟雾剂（范会雄等，1996）和热雾剂防治（蔡志英和黄贵修，2011;许丽月等，2012）。王兰英等（2010）开展8种杀菌剂对橡胶炭疽菌的抑制活性试验，证明百菌清、抑霉唑和嘧菌酯对橡胶炭疽病的抑制效果较好。郑肖兰等（2014）通过开展戊唑醇与苯醚甲环唑混配对橡胶树炭疽病菌的联合毒力测定试验，结果发现戊唑醇与苯醚甲环唑以1∶3混配对胶孢炭疽菌的抑制作用增效明显。至今，针对该病害开展生物防治方面的研究鲜见报道。樊兰艳（2013）研究发现，枯草芽孢杆菌Czk1抗菌活性物质为脂肽类粗提物，其对橡胶炭疽病有一定的抑制及抗性诱导作用。生物—化学协同防治在烟草青枯病、油茶炭疽病和芒果炭疽病等多种植物病害防治研究中均有良好效果（黄小琴等，2015;李昕，2015）。韩丽等（2013）开展了枯草芽孢杆菌B26与化学药剂协同防治木材蓝变研究，结果表明，枯草芽孢杆菌B26与戊唑醇按体积比6∶4复配时对蓝变菌的抑制有明显增效作用。谷春艳等（2018）用解淀粉芽胞杆菌WH1G与咪鲜胺复配协同防治草莓炭疽病，室内生物测定结果表明，当咪鲜胺∶WH1G配比为5∶5（v/v）时对病菌抑制的增效作用和防治效果最佳，毒性比率为1.432，防效为69.94%;复配剂对草莓炭疽病的田间防效达67.91%，二者复配不仅可提高对草莓炭疽病的防效，还能有效减少化学药剂的使用量。谢立等（2020）用枯草芽孢杆菌Czk1与化学杀菌剂协同防治橡胶树根病，当Czk1∶根康配比为7∶3（v/v）时，对红根病菌的增效比率（IR）为1.86，对褐根病菌的IR为1.51，增效作用最佳。【本研究切入点】前期研究发现枯草芽孢杆菌Czk1对橡胶炭疽病菌具有较好的抑制作用，亦可诱导橡胶植株产生系统抗性（赵璐璐，2011），具有开发成为微生物农药的潜力，但单一的生物防治缺乏防治效果的稳定性和长久性，且在大田防效上不显著。目前，关于橡胶炭疽病的生物—化学协同防治研究尚未见报道。【拟解决的关键问题】筛选生产中常用防治橡胶炭疽病且能与枯草芽孢杆菌Czk1具有很好相容性的化学杀菌剂并与Czk1进行复配，测定复配剂对橡胶炭疽病菌的抑菌活性，构建由生防菌与化学杀菌剂组成的菌药复配剂，为橡胶炭疽病的可持续防治提供科学依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

1. 1. 1 供试杀菌剂 咪鲜胺、百菌清、根康、嘧霉胺、丙环唑和嘧菌酯。6种化学杀菌剂的剂型、含量、生产厂家及供试浓度见表1。

1. 1. 2 供试培养基 PDA培养基、LB培养基和固体培养基的制备参照谢立等（2020）的方法。

1. 1. 3 供试菌株 枯草芽孢杆菌（Bacillus subti-lis）Czk1和橡胶胶孢炭疽菌RC178均由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所分离和保存。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 6种化学杀菌剂对RC178的毒力测定 采用菌丝生长速率法测定6种化学杀菌剂对RC178的室内毒力。参照谢立等（2020）的方法，配制含不同浓度供试6种化学杀菌剂的PDA培养基，接入RC178菌饼，置于培养箱中培养，测定并计算不同杀菌剂对RC178的平均抑制率。

1. 2. 2 Czk1与6种化学杀菌剂的生物相容性测定

采用稀释平板涂布法测定6种杀菌剂与Czk1的相容性。将实验室保存的Czk1菌液平板划线纯化分离后获得Czk1单菌落，取Czk1菌株单菌落1 μL接入99 mL已灭菌的LB液体培养基中，于37 ℃恒温条件下培养12 h备用。参照谢立等（2020）的方法，配制含不同浓度供试6种化学杀菌剂的LB培养基，平板稀释涂布法将100 μL Czk1稀释菌悬液均匀涂布在LB含药培养基表面，置于37 ℃下恒温培养。分别于培养第2、5和10 d检测Czk1菌体情况，取样涂片用尼康生物显微镜NI-E检查孢子萌发情况，孢子分离取样参照张筱梅等（2016）的方法。每处理5次重复，以加等量无菌水为空白对照（CK）。

1. 2. 3 单剂Czk1对橡胶树炭疽病菌的毒力测定

采用抑菌圈法测定Czk1对RC178的室内毒力。根据1.2.2方法，将单剂Czk1摇菌12 h后，配制其含菌量浓度分别为1.00×104、1.00×105、1.00×106、1.00×107、1.00×108和1.00×109 CFU/mL。参照谢立等（2020）平板对峙法的滤纸片法，计算其平均抑制率、有效抑制中浓度（EC50）、有效抑制75%真菌生长所需的浓度（EC75）和相关系数（r）。

1. 2. 4 复配剂对橡胶炭疽病菌的毒力测定 根据单剂毒力测定结果，以对橡胶炭疽菌抑制效果较佳且与Czk1具有较好相容性的杀菌剂进行菌药复配，单剂EC50为基础，配制两单剂的有效抑制中浓度药液，并按体积比Czk1∶杀菌剂=0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1和10∶0不同配比进行复配。参照谢立等（2020）的方法，计算平均抑制率、理论抑菌率;并采用Horsfall法计算联合毒力增效（尹敬芳，2006）。

1. 3 统计分析

采用SPSS 11.0、Excel 2019.0和JMP 10.0进行数据统计分析，采用Duncans新复极差法进行数据差异显著性检验。

2 结果与分析

2. 1 6种化学杀菌剂对RC178的室内毒力测定结果

6种化学杀菌剂对RC178均具有不同程度的抑制作用，且随着药剂质量浓度增加其毒力不断增强，但不同化学杀菌剂对RC178的抑制效果存在明显差异（表2）。6种杀菌剂中咪鲜胺对橡胶炭疽菌的抑菌效果最好，其EC50仅为0.0778 μg/mL，其次为百菌清和根康，EC50分别为0.4694和0.4733 μg/mL;嘧霉胺和丙环唑的抑菌效果一般;嘧菌酯的EC50最大，为3.8388 μg/mL，在6种供试杀菌剂中其抑菌效果最差。

2. 2 Czk1与杀菌剂的相容性测定结果

由表3可知，Czk1与6种化学杀菌剂的相容性存在差异，在化学杀菌剂较低浓度（0.05～0.10 μg/mL）时Czk1均能正常生长;当化学杀菌浓度≥0.25 μg/mL时百菌清出现明显的抑制效果，基本抑制Czk1的生长和孢子萌发，不能与Czk1很好相容;嘧菌酯、嘧霉胺、丙环唑和根康4种杀菌剂无论在高浓度或低浓度条件下，Czk1均能正常生长，相容性较好，且根康在中高浓度条件下还会促进Czk1菌落数量的增长;咪鲜胺与Czk1的相容性也较好，但当浓度达1.00 μg/mL时会轻微抑制Czk1生长。综合6种化学杀菌剂的毒力测定及与Czk1相容性测定结果，分别选择咪鲜胺和根康作为菌药复配因子。

2. 3 根康和咪鲜胺与Czk1复配剂对RC178的毒力测定结果

2. 3. 1 单剂Czk1对RC178的毒力测定 由表4可知，随着Czk1菌落数量的增加，Czk1对RC178的生长抑制效果越明显，Czk1菌落数量在1.00×109 CFU/mL时对RC178的抑制率达60.25%，而菌落数量稀释至1.00×104 CFU/mL时其抑制率只有11.89%。通过毒力回归方程测定Czk1菌液对RC178的EC50为4.75×107 CFU/mL。

2. 3. 2 复配剂对橡胶炭疽病菌的联合毒力测定

根据以上试验结果，将浓度为0.0778 μg/mL的咪鲜胺与浓度为4.75×107 CFU/mL的Czk1發酵液按不同体积比进行复配，联合毒力测定结果见表5。Czk1与咪鲜胺以体积比1∶9、5∶5、6∶4、7∶3和8∶2复配时对RC178的抑制效果有明显增效作用，实际抑菌效果分别为56.54%、75.39%、65.97%、65.45%和81.15%，对应的IR为1.35、1.64、1.40、1.36和1.65;其中复配比例为8∶2时的IR最大，增效作用最强，防效最好，因此选取Czk1∶咪鲜胺=8∶2作为最佳复配比。

将浓度为4.75×107 CFU/mL的Czk1发酵液与浓度为0.4733μg/mL的根康以不同体积比进行复配，Czk1与根康体积比分别为4∶6、5∶5、6∶4、7∶3和8∶2时对RC178的抑制效果具有明显增效作用，实际抑菌效果分别为74.78%、76.37%、82.54%、88.32%和80.60%，对应的IR分别为1.26、1.25、1.31、1.36和1.21;其中复配比例为7∶3时的IR最大，增效作用最强，防效最好，因此选取Czk1∶根康=7∶3为最佳复配比。

3 讨论

胶孢炭疽菌可通过风雨、昆虫等媒介传播，从植株伤口、气孔和表皮等途径入侵，一旦感病暴发流行不易控制，严重影响橡胶的产量和质量（孟祥春等，2018）。现阶段防治橡胶炭疽病仍以化学防治为主，但化学防治药剂品种较单一，长期施用同一杀菌剂易使病菌产生抗药性。罗大全等（2003）、曹学仁等（2015）对海南垦区橡胶炭疽病菌对多菌灵抗性室内测定结果表明，长期施用多菌灵的农场炭疽菌对多菌灵的敏感性明显降低，产生一定抗药性。林春花等（2017）测定了我国2种橡胶树炭疽病菌对咪鲜胺的敏感性，发现我国4个植胶区2种类型橡胶炭疽病菌对咪鲜胺的敏感性无明显差异，对橡胶炭疽病菌抑菌效果较好，可作为生产上的防治药剂。本研究通过6种常见化学杀菌剂对橡胶炭疽病菌的毒力测定表明，内吸式杀菌剂咪鲜胺对RC178的抑菌效果最好，广谱性杀菌剂百菌清次之，三唑类杀菌剂根康对RC178的抑菌效果也较好。这与生产中主要采用咪鲜胺和百菌清等药剂防治橡胶炭疽病害结果一致（Guyot et al.，2001）。

本研究通过化学杀菌剂与Czk1的相容性测定，发现嘧霉胺、嘧菌酯、丙环唑、根康和咪鲜胺与生防菌Czk1的相容性均较好，其中咪鲜胺在较高化学浓度下仍能使Czk1正常生长，对其无明显抑制;同时发现中高浓度的根康不仅未抑制Czk1生长，还会促进Czk1菌落数量的增长。根康对橡胶红根病和褐根病的防治效果显著，田间平均防效可达78%以上（贺春萍，2016），选用根康与枯草芽孢杆菌进行复配，筛选出最佳复配组合，有望获得兼治橡胶根病和炭疽病等多种病害复配剂组合，起到一药多效的作用。本研究通过室内毒力测定及相容性测定，最终选用咪鲜胺和根康分别与Czk1混配。唐文（2016）进行枯草芽孢杆菌对橡胶树体内的定殖及防病促生机理研究，结果表明，Czk1不仅能诱导橡胶树产生系统抗性防治橡胶炭疽病害，还对橡胶生长具有促进作用。本研究发现，Czk1菌落数量在1.00×109 CFU/mL时对RC178的抑制率达60.25%，表明Czk1与咪鲜胺、根康具有开发成菌药制剂的潜力。

本研究结果突破防治橡胶树炭疽病以化学药剂为主要防治手段的局限性，采用生物与化学协同防治新策略，在提高防效的同时有效减少了化学农药使用量，不仅能发挥化学杀菌剂抑菌效果快、防治效果稳定的优势，还弥补了微生物在生防防治过程中存在易受环境影响、抗菌谱窄、防效缓慢等不足，从而延缓病原菌对化学杀菌剂的抗药性，提高生防菌抑菌效果的稳定性（陈志谊等，2002;邱雪迎等，2019）。化学药剂能降低习居微生物（包括病原菌）对生防微生物的排斥作用，使其能顺利定殖、生长，并逐步发展成优势种群微生物，更好地发挥生物防治的作用（刘晓妹等，2013;Ogbebor et al.，2015）。通过菌药复配协同作用达到菌药优势互补、化学农药用量减少、田间防效增加的目的，实现对多种病害的兼治作用与持续效果，具有广阔的推广应用前景（毕秋艳等，2018）。由于本研究仅针对室内复配研究，室外环境因子如温度、湿度和光照对RC178的孢子定殖、生长以及对枯草芽孢杆菌在植株上的定殖、生长影响明显，因此，需进一步对盆栽和大田试验进行防效验证，以便更好地为复配剂的使用提供科学依据。

4 结论

枯草芽孢杆菌Czk1与咪鲜胺和根康具有较好的相容性，Czk1发酵液分别与咪鲜胺和根康按体积比8∶2和7∶3进行复配时对橡胶炭疽病菌RC178的抑菌效果最佳，混剂的防治效果明显优于单剂Czk1、根康和咪鲜胺，增效作用明显，具有开发成菌药制剂的潜力。

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（責任编辑 麻小燕）