施用中药渣堆肥对土地整治区新改土土壤细菌多样性及群落结构的影响

罗友进 廖敦秀 韩国辉 胡佳羽 张慧 余端 李燕 谢永红

摘要：【目的】探討施用中药渣堆肥对土地整治区新改土土壤细菌多样性及群落结构的影响，为土地整治区新改土的培肥及中药渣的资源化利用提供科学依据。【方法】采用Illumina MiSeq平台高通量测序技术，在高粱—油菜轮作模式下，设4种中药渣堆肥用量处理，分别为复合肥900 kg/ha（CK）、中药渣堆肥30 t/ha+复合肥900 kg/ha（ZYZ1）、中药渣堆肥60 t/ha（ZYZ2）和中药渣堆肥90 t/ha（ZYZ3），高粱收获后采集0～20 cm土层样品，测定土壤基本理化性质，进行土壤细菌16S rRNA测序，并分析土壤细菌多样性、群落构成及相对丰度，并进行土壤理化性质与细菌群落多样性的相关分析。【结果】与CK相比，随着中药渣堆肥用量的增加，土壤pH和有机质含量逐渐升高，土壤全钾含量先降低后升高，土壤全磷和速效钾含量先升高后降低;各中药渣堆肥处理的土壤铵态氮、硝态氮和水溶性磷酸根含量均显著低于CK（P<0.05）。基于16S rRNA的高通量测序共获得119108个有效序列，得到7759个OTUs。施用中药渣堆肥会改变新改土土壤细菌群落组成，增加了5～6个土壤细菌菌门数量;提高了绿弯菌门（Chloroflexi）和酸杆菌门（Acidobacteria）的相对丰度，增幅分别为7.1%～16.7%和5.4%～10.6%;降低了变形菌门（Proteobacteria）的相对丰度，降幅为8.4%～21.2%。多样性分析结果表明，随着中药渣堆肥用量的增加，土壤细菌多样性表现出先增加后减少的变化趋势。聚类分析结果表明，4个处理归为2类，即CK和ZYZ3、ZYZ1和ZYZ2。冗余分析结果表明，土壤细菌群落主要受pH、NO3--N和有效钾含量的影响，同时有机质、全钾、P3O43-和NH4+-N也对其有一定影响。【结论】施用中药渣堆肥能提升土地整治区土壤肥力，改善其细菌群落组成，但要合理控制其施用量，以施用30 t/ha中药渣堆肥+复合肥900 kg/ha与施用60 t/ha中药渣堆肥为佳。

关键词： 新改土;土地整治区;中药渣堆肥;细菌多样性;细菌群落结构

中图分类号： S156;S154                      文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2020）10-2394-07

Effects of herb residue compost on soil bacterial diversity and community structure of new reconstructed soil in restoration area

LUO You-jin1， LIAO Dun-xiu2， HAN Guo-hui1， HU Jia-yu1， ZHANG Hui2，

YU Duan2， LI Yan2*， XIE Yong-hong1

（1Fruit Research Institute， Chongqing Academy of Agricultural Sciences， Chongqing  401329， China; 2Institute of Environment and Resources in Agriculture， Chongqing Academy of Agricultural Sciences，Chongqing  401329， China）

Abstract：【Objective】The experiment was conducted to explore the effects of herb residue compost on soil bacterial diversity and community structure in land reconstructed area in order to provide scientific basis for the fertilization of newly reconstructed soil and utilization of herb residue compost. 【Method】The illumina platform MiSeq high-throughput sequencing technology was used to sequence facility soil bacteria 16s rRNA from four treatments [chemical fertilizer 900 kg/ha（CK），  herb residue compost 30 t/ha and chemical fertilizer 900 kg/ha（ZYZ1），  herb residue compost 60 t/ha（ZYZ2） and  herb residue compost 90 t/ha（ZYZ3）] in sorghum-rape rotation system after sorghum harvested， and the soil basic physical and chemical properties of 0-20 cm soil layer was detected by traditional chemical methods. The diversity， structure and relative abundance of soil bacteria and the correlation between soil bacteria community composition and soil basic properties was analyzed. 【Result】The results showed that the soil organic matter content and pH was increased with herb residue compost application increased compared with CK， soil total potassium content was increased first and then decreased， soil total phosphorus content and available potassium content were decreased first and then increased， and the contents of soil ammonium nitrogen， nitrate nitrogen and water-soluble phosphate were significantly decreased in herb re-sidue compost application treatments（P<0.05）. A total of 7759 operational taxonomic units（OTUs） and 119108 effective sequences were detected based on 16S rRNA high-throughput sequencing. Herb residue compost application could change soil bacterial composition， increase the number of five to six bacterial phyla. It also increased the relative abundance of Chloroflexi and Acidobacteria increased by 7.1%-16.7% and 5.4%-10.6% respectively， but that of Proteobacteria decreased by 8.4%-21.2%. Diversity analysis indicated that， soil bacterial diversity increased and then decreased with the increasing of herb residue compost application amounts. Hierarchical clustering results showed that the four treatments was clustered into two groups， CK and ZYZ3，ZYZ2 and ZYZ1. Redundancy analysis also showed that soil bacterial community was mainly affected by pH，NO3--N and available potassium，and also affected by organic matter，total potassium， P3O43- and NH4+-N. 【Conclusion】In general， the soil fertility and bacterial community of land restoration area can be  improved by application of herb residue compost， but the application amount should be  controlled. The optimal amount is herb residue compost 30 t/ha+chemical fertilizer 900 kg/ha and herb residue compost 60 t/ha.

Key words： newly reconstructed soil; land restoration area; herb residue compost; bacterial diversity; bacterial community

Foundation item： National Key Research and Development Program of China（2018YFD0800606）; Incentive and Guidance Special Project of Chongqing Research Institutes（CSTC2018JXJl80033，CSTC2017JXJl80020）;Major Innovation Project for Agriculture Science and Technology of Chongqing Academy of Agricultural Sciences（NKY2017 AB002）

0 引言

【研究意义】土地整治以增加耕地面积，提升粮食产能为主要目的，是目前土地利用管理的重要手段之一（Yan et al.，2015），但其更多关注新增耕地数量，而对新增耕地质量关注较少。土地整治工程多采用挖高填低、表土剥离及有机肥培肥等方式，在优化生产和维持农田景观功能的同时，会对农田生态，尤其是土壤生态（微生物群落等）造成大幅干扰（王军等，2011）。土壤微生物在维持土壤生态功能中扮演着重要角色（Nannipieri et al.，2003），其中细菌在土壤微生物数量中占有绝对优势，决定着土壤微生物总量的分布，影响着有机物的分解和转化（Zimmerman，2010）。随着我国中药产业的发展，中药渣废弃量越来越大，以中药渣为原材料生产有机肥，合理科学利用中药渣有机肥进行改土培肥是实现中药渣资源化利用的有效方式之一（常义军等，2010）。因此，探讨施用中药渣有机肥对土地整治区土壤细菌多样性和群落结构影响，对土地整治区土壤培肥和可持续利用具有重要意義。【前人研究进展】国内外关于施用有机肥对土壤细菌多样性和群落结构影响的研究主要集中于农田，而对土地整治区新改土影响相对较少。白震等（2008）通过黑土肥料定位试验研究，发现施用有机肥可显著增加土壤微生物量碳/氮及真菌和细菌的磷脂脂肪酸含量，提高土壤真菌/细菌比值，且生物群落结构显著不同于化肥处理。丁建莉等（2016）依据长期定位试验指出，在玉米—大豆轮作条件下，有机无机肥配施能有效改变土壤微生物群落结构，提高微生物的丰度和多样性，并提高土壤pH，减缓土壤酸化。杜思瑶等（2017）通过分析有机和常规种植条件下土壤细菌多样性和群落结构，发现有机种植土壤含有较多的能促进植物生长和有机质分解的细菌。郭芸等（2017）研究指出，有机无机肥长期配施能显著增加土壤真菌、细菌和放线菌的生物量;短期施肥则对土壤细菌多样性及其活性的影响相对较小。于冰等（2017）研究发现，在长期施用有机肥条件下，土壤细菌种群丰度和多样性增加，群落结构发生显著改变，能支持更大、更丰富的微生物群体。刘晓丹等（2019）研究表明，有机物料部分替代化肥氮可提高麦田土壤的微生物量和微生物活性，优化微生物区系组成。潘义宏等（2019）研究表明，氨基酸菜籽饼肥和甲壳素氨基酸有机肥与无机肥按不同比例配施均能在一定程度上提高土壤微生物数量和土壤综合肥力。目前，在土地整治区土壤细菌多样性和群落结构的研究方面，林耀奔等（2019）通过对比分析土地整治区内外土壤微生物多样性与种群结构，发现土地整治区内土壤细菌的多样性显著提高，有机肥施用显著提高了微生物多样性及鞘脂单胞菌和地杆菌等土壤有益菌的丰度;施昊坤等（2020）研究了土地整治对工业区周边土壤微生物多样性和群落结构的影响，结果表明，土地整治降低了变形菌门的相对丰度，提高了绿弯菌门和酸杆菌门及鞘脂单胞菌和地杆菌的相对丰度，土壤微生物多样性和功能性明显得到改善。【本研究切入点】紫色丘陵土地整治区新改土土壤养分含量低，微生物群落组成简单，结构性、保水保墒能力、通气性和肥力供应能力差。增施有机肥是解决紫色丘陵土地整治区土壤培肥的关键环节，但目前关于中药渣堆肥在紫色土地整治区新改土培肥中的研究较少，尤其是对其土壤微生物群落结构影响的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】以紫色丘陵土地整治区新改土为研究对象，采用Illumina MiSeq平台高通量测序技术，研究中药渣堆肥用量对新改土土壤细菌多样性及群落结构的影响，以期为土地整治区新改土的培肥及中药渣的资源化利用提供科学依据。

1 材料与方法

1. 1 试验地概况

试验地位于重庆市农业科学院现代农业高科技园区，年均气温18.3 ℃，年均日照时数1000～1400 h，年均降水量1135.6 mm。该园区于2016年完成土地整治工程，试验前土壤pH 6.60，有机质9.33 g/kg，全磷0.046 g/kg，全钾22.04 g/kg，硝态氮28.5 mg/kg，铵态氮16.8 mg/kg。

1. 2 试验方法

试验始于2016年，采用高粱—油菜轮作种植模式，高粱品种为国窖红1号，油菜品种为中双11号。试验共设4个处理，采用大区试验，每个大区面积为20 m×30 m，各处理肥料施用情况详见表1。其中复合肥为九禾复合肥（喜悦大地），N-P2O5-K2O含量为26-10-16;中药渣堆肥由重庆土原生物科技有限公司生产，pH 7.01，有机质含量58.5%，总养分为5.76%。中药渣堆肥在高粱移栽前施入，利用深松机和旋耕机将其充分混入土壤中并耙平;复合肥于油菜/高粱定植前一次性施入，油菜和高粱栽植密度为60000～75000株/ha，试验各处理栽培管理措施保持一致。

1. 3 土壤样品采集

2017年9月高粱收获后，在各处理试验大区的对角线上采集0～20 cm土壤耕层混合样3个，每个土壤耕层混合样按照“W”形采样法采集5个点，充分混匀作为1个耕层土壤样品，将每个土样分为2份，一份约1 kg用于土壤理化性质测定，-4 ℃保存;另一份约100 g用于土壤细菌群落分析，-80 ℃保存。

1. 4 测定指标及方法

土壤pH使用pH计测定（土水比1∶5）;有机质含量采用重铬酸钾滴定法测定;全磷含量采用钼锑抗比色法测定;全钾和速效钾含量采用火焰光度法测定;铵态氮、硝态氮和磷酸盐含量采用连续流动分析仪（SKALAR SAN++）测定（鲁如坤，2000）。

土壤细菌群落分析由上海派森诺生物科技股份有限公司（上海）完成，采用Illumina MiSeq平台对细菌群落DNA片段进行双端（Paired-end）测序。

1. 5 统计分析

采用QIIME进行土壤细菌群落相关指标分析;采用SPSS 20.0对土壤基本属性进行显著性分析;采用Canoco 5.0对土壤菌群结构与环境因子进行主成分分析和冗余分析。

2 结果与分析

2. 1 不同中药渣堆肥用量对新改土土壤理化性质的影响

由表2可知，与CK相比，随着中药渣堆肥用量的增加，土壤pH和有机质含量逐漸升高;土壤全钾含量先降低后升高，但各中药渣堆肥处理与CK无显著差异（P>0.05，下同）;土壤全磷和速效钾含量先升高后降低，均以ZYZ1处理最高，与CK差异显著（P<0.05，下同）;土壤铵态氮、硝态氮和水溶性磷酸根含量均以CK最高，且显著高于各中药渣堆肥处理。

2. 2 土壤测序结果分析

基于16S rRNA的高通量测序共获得119108个有效序列，基于相似度97%进行聚类分析，得到7759个OTUs（图1和表3）。从图1可知，不同中药渣堆肥用量处理土壤细菌的稀疏曲线趋于平缓，意味着土壤细菌测序列库容可较好地反映细菌的种类和数量，基本涵盖了土壤所有细菌种群。

2. 3 土壤细菌α多样性分析

根据细菌OTUs数量计算出各处理的土壤细菌α多样性指数（相似度为97%）。从表3可看出，土壤细菌Shannon指数和Simpson指数以ZYZ2处理最高，其次是ZYZ3和ZYZ1处理，CK最低;土壤细菌Chao1指数和ACE指数以ZYZ3处理最高，其次是ZYZ1处理和CK，ZYZ2处理最低，且不同处理间的差异均达显著水平。说明随着中药渣堆肥施用量的增加，土壤细菌多样性表现出先增加后减少的变化趋势，丰富度表现出升高—降低—升高的波动变化趋势。

2. 4 土壤细菌群落组成分析

由图2可看出，土壤细菌群落主要由变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、酸杆菌门（Acidobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）等38个菌门组成。其中变形菌门占21.82%～43.05%，放线菌门占10.64%～34.14%，绿弯菌门占8.57%～25.13%，芽单胞菌门占6.16%～17.43%，酸杆菌门占4.14%～14.81%，这5个菌门在样本群落结构中占主导地位，分别占CK、ZYZ1、ZYZ2和ZYZ3处理样本总量的87.45%、89.64%、92.81%和90.30%。与CK相比，施用中药渣堆肥处理提高了绿弯菌门和酸杆菌门的相对丰度，增幅分别为7.1%～16.7%和5.4%～10.6%;降低了变形菌门的相对丰度，降幅为8.4%～21.2%。与CK相比，ZYZ1、ZYZ2和ZYZ3处理含有的土壤细菌菌门数分别增加了6、5和5个，即表明施用中药渣堆肥会改变新改土土壤细菌群落组成。中药渣堆肥处理中含有Latescibacteria、GAL15、Aminicenantes和Tectomicrobia等4个特有菌门。同时，将各处理的细菌群落进行聚类分析，结果（图2）显示，CK和ZYZ3与ZYZ1和ZYZ2归为2类，表明在施用中药渣堆肥对新改土进行改良时要注意用量，中药渣堆肥用量过大会导致土壤细菌群落菌门数减少，同时相对丰度也会趋于简单。

2. 5 土壤细菌群落结构与土壤理化性质的相关分析

通过对土壤细菌群落多样性指标与土壤基本理化性质进行冗余分析，结果（图3）发现，在门的水平上，轴1和轴2分别解释了变量的78.09%和13.01%。分析4个处理间的欧几里德距离，施用中药渣堆肥处理与CK的土壤群落结构差异明显，但随着中药渣堆肥用量的增加，这种差异有减弱趋势。AK、pH与NO3--N对土壤细菌群落结构的影响最大。其中AK与Planctomycetes呈正相关，与芽单胞菌门呈负相关;pH与绿弯菌门呈正相关;NO3--N与Saccharibacteria呈正相关，与酸杆菌门和绿弯菌门呈负相关。SOM对土壤细菌群落结构的影响较大，Ignavibacteriae与其呈正相关，芽单胞菌门与其呈负相关。另外，TK、NH4+-N和P3O43-对土壤细菌群落结构也有一定影响。

3 讨论

3. 1 施用中药渣堆肥对整治区新改土细菌数量的影响

土壤细菌在土壤养分转化、循环及维持土壤生物群落稳定性与生态系统抗干扰能力中起重要作用（Doran and Zeiss，2000;Girvan et al.，2005）。土壤细菌数量增多和群落结构组成多元化有利于土壤微生物群落结构恢复及生物肥力提升。王秋君等（2009）研究表明，施入菜粕堆肥、猪粪堆肥和中药渣堆肥等外源有机物能改变土壤微生物细菌群落结构，施入化肥则对土壤细菌群落结构影响较小。李倩等（2018）研究发现，化肥配施牛粪或羊粪有利于提高土壤微生物生物量，同时认为这是由土壤有机碳含量、腐殖质形态变化所引起。本研究结果表明，施用中药渣堆肥处理土壤中细菌OTUs增加，以ZYZ3处理增加最多，表明施用中药渣堆肥有助于提升土地整治区新改土土壤微生物群落结构的恢复，其原因可能是施用中药渣堆肥提升了土壤pH，增加了土壤中有机质、铵态氮、硝态氮和水溶性磷酸根含量。

3. 2 施用中药渣堆肥对整治区新改土细菌群落结构和多样性的影响

在评价土壤细菌群落多样性时主要采用Shannon指数、Simpson指数、Chao1指数及ACE指数等多样性指数，多样性指数越高即意味着土壤细菌群落丰富度和多样性越高。关于施用有机肥对土壤细菌群落多样性的影响，不同学者的研究结果存在一定差异。苏婷婷等（2016）研究指出，配施生物有机肥和磷肥可改善新整理黄壤烟田的土壤细菌群落结构;而杨亚东等（2018）则认为，施用有机肥和化肥的小麦土壤细菌多样性指标均不存在显著差异。本研究结果表明，与施用化肥相比，施用中药渣堆肥土壤细菌群落多样性呈现先增加后减少的变化趋势。这种差异可能与土壤性质、作物种类、施用量等有关，但也表明在施用中药渣堆肥进行土壤培肥改良时要控制其施用量。

本研究利用Illumina MiSeq平台对施用中药渣堆肥后新改土的土壤细菌群落结构进行研究，得到38个门水平的类群，从细菌群落门水平组成来看，变形菌门、放线菌门、绿弯菌门、芽单胞菌门和酸杆菌门这5个菌门在细菌群落结构中占主导地位，占85%以上，与Liu等（2014）、孙瑞波等（2015）、杨亚东等（2018）在不同类型农田土壤中得到的细菌优势类群相似。不同研究中各优势类群的相对丰度差异明显，侯建伟等（2018）研究指出，农田土壤细菌优势类群受到土壤类型或质地和种植作物等的影响;杨亚东等（2018）的研究则表明土壤中放线菌的相对丰度与土壤含水量和pH存在显著负相关。在本研究中，当施入中药渣堆肥为60 t/ha时，土壤放线菌相对丰度较其他处理高，土壤pH也较其他处理高，其具体原因尚需进一步研究。

施用中药渣堆肥有助于整治区新改土土壤细菌群落组成和结构的改善，但本研究仅分析了土壤细菌群落的整体变化，并未对中药渣堆肥特殊成分及特殊功能类群的微生物进行研究。特殊功能类群微生物参与不同的土壤代谢途径，中药渣堆肥的施用会引起土壤细菌数量、多样性和群落结构的变化，是否会导致土壤健康状况和生态系统功能变化均有待进一步研究。

4 结论

施用中药渣堆肥有助于改善土地整治区新改土的土壤肥力，可提升土壤细菌多样性和丰富度，但需合理控制施用量，以施用30 t/ha中药渣有机肥+复合肥900 kg/ha与施用60 t/ha中药渣堆肥为佳。

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（责任编辑 王 晖）