β-葡萄糖苷酶在酒类酿造中研究进展

刘晓柱，张远林，黎 华，李银凤，于志海，刘晓辉，黄名正

（贵州理工学院食品药品制造工程学院，贵州贵阳 550000）

β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）EC3.2.1.21又称β-D-葡萄糖苷酶，1837年由LIEBIG在苦杏仁汁中发现，为一种水解酶[1]。β-葡萄糖苷酶能水解含β-D-葡萄糖苷键底物，释放出葡萄糖和具有香气特性的游离糖苷配体，从而促进香气物质的产生，被广泛应用于食品、药品、保健品等领域的增香[2]。β-葡萄糖苷酶来源广泛，几乎所有类生物体细胞都可以产生，包括动物细胞、植物细胞和微生物细胞等。对于β-葡萄糖苷酶的研究也一直为国内外研究者关注的热点之一，包括酶学性质的分析、酶基因的克隆与高效表达、产酶菌株的选育与发酵条件优化、酶的应用等。为此，本文综述了近年来国内在产β-葡萄糖苷酶酿酒微生物选育以及β-葡萄糖苷酶在酒类酿造领域中的应用研究进展，以期为进一步扩大β-葡萄糖苷酶酿酒微生物菌种的选育和应用提供一定的参考。

1 产β-葡萄糖苷酶酿酒微生物的筛选与鉴定

筛选高产β-葡萄糖苷酶酿酒微生物并将其应用于酒类的增香，以提升酒体的香气成分和品质是近年来酒类研究领域科研工作者的一个重要的研究方向。目前已发现的产β-葡萄糖苷酶酿酒微生物包括霉菌、酵母菌和细菌三大类。

1.1 酵母菌

酵母菌是酒类酿造中常用生产菌种，包括酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）和非酿酒酵母（non-Saccharomyces）两大类。酿酒酵母主要将果汁中的糖转化为酒精和二氧化碳，发酵速度快、发酵力强。非酿酒酵母可产生多种胞外酶，如β-葡萄糖苷酶、蛋白酶、淀粉酶等，这些酶水解原料中相关底物，影响酒体中风味物质组成。因此，筛选高产β-葡萄糖苷酶酵母菌株，并用于酒类的酿造是酿酒微生物学研究的一个重要方向。

1.1.1 酿酒酵母

周立华等[3]从河北沙城葡萄产区龙眼葡萄自然发酵后期分离到一株高产β-葡萄糖苷酶酿酒酵母菌株KDLYS9-16（GenBank登录号：KX119943），该菌株用于发酵赤霞珠和美乐葡萄酒时，与商业化酿酒酵母F15、SC相比，具有降糖迅速、发酵周期短，发酵速率快，酒精转化率高等优势，同时还增加了葡萄酒中香气物质的种类和含量，具有较好的应用潜能；李庆华等[4]利用对硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷（p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，p-NPG）显色法从120株酵母中鉴定出2株产高产β-葡萄糖苷酶菌株NX-9和NE-8，其产酶活性分别为4 517.3 U/mL、4 222.58 U/mL，与工业菌株VL1产酶量较为接近；侯晓瑞等[5]在甘肃河西走廊葡萄产区葡萄自然发酵液中分离到的115株酵母菌株中，利用p-NPG初筛，摇瓶复筛，得到5株高产β-葡萄糖苷酶酿酒酵母菌，它们的产酶活性与商业酵母ICV-D254相似；王英等[6]从23株酵母中筛选出1株β-葡糖苷酶活性较低的酿酒酵母FY4，但该菌株可增加黑莓果酒中花色苷的含量，为同等发酵条件下商业化酿酒酵母发酵黑莓果酒中花色苷含量的1.53倍。

1.1.2 非酿酒酵母

马得草等[7]对从宜宾白酒酒窖中分离到的133株野生酵母进行七叶苷显色分析，初筛到19株显色较深的菌株，p-NPG法进一步从中分离出2株β-葡糖苷酶活性高且稳定的酵母菌株H5Y1和Z9Y3。结合在WL培养基上菌落特征、细胞显微形态以及分子检测结果，鉴定菌株H5Y1和Z9Y3为发酵毕赤酵母（Pichia fermentans）；张敏等[8]从新疆石河子葡萄产区葡萄自然发酵液中分离到一株高产β-葡萄糖苷酶毕赤酵母属（Pichiasp.）非酿酒酵母菌Y8；徐亚男等[9]从新疆赤霞珠葡萄酒发酵过程中，通过对非酿酒酵母进行筛选，得到一株β-葡萄糖苷酶酶活较高的克鲁维毕赤酵母（Pichia kluyveri）XYN086；侯晓瑞等[5]从甘肃河西走廊葡萄产区自然发酵葡萄液中鉴定出1株产β-葡萄糖苷酶梅奇属酵母（Metschnikowiasp.）QLFE-4；王玉霞[10]首次报道了阿氏丝孢酵母（Trichosporon asahii）能够产β-葡萄糖苷酶，其中菌株F6的β-葡萄糖苷酶酶活最高，该菌株是从张裕集团胶东半岛葡萄酒生产基地采集样品中分离得到的。该研究还发现葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）、Candida railenensi、发酵毕赤酵母（Pichia fermentans）、季也蒙毕赤酵母（Pichia guilliermondii）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）均可产生β-葡萄糖苷酶；蒋文鸿[11]从河北昌黎和河南济源分离的189株野生酵母中，检测到“济13”菌株的产酶活性最好，“济45”、“昌29”次之，形态鉴定与分子鉴定的结果表明，“济13”为膜璞毕赤酵母（Pichia membranifaciens），“济45”为葡萄芽棒孢酵母（Clavispora lusitaniae），“昌29”为胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）；王佳等[12]分析了宁夏贺兰山东麓分离的941株野生酵母，发现陆生伊萨酵母（Issatchenkia terricola）、核果梅奇酵母（Metschnikowia fructicola）、季也蒙毕赤酵母（Pichia guilliermondii）、库德毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）和胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）均具有较高的产β-葡萄糖苷酶能力；王凤梅等[13]对内蒙古西部分离到的340株酵母的分析结果表明，葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、浅黄隐球酵母（Cryptococcus flavescens）、异常毕赤酵母（Pichia anomala）及星形假丝酵母（Candida stellate）均能产β-葡萄糖苷酶。

1.2 霉菌

黑曲霉（Aspergillus niger）是一种常见霉菌类工业化生产菌，其合成的β-葡萄糖苷酶在食品、医药等领域被广泛应用。但目前产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉在酿酒领域应用还比较少。郭慧女[14]研究报道，通过对p-NPG显色法从葡萄园的土壤及葡萄表皮筛选到3株产β-葡萄糖苷酶较高的菌株，经分子比对分析，酶活最高的一株为黑曲霉，酶活达15.3 U/mL。此外，刘德海等[15]采用纤维二糖为唯一碳源法结合纤维素-刚果红变色圈法，从酿造大曲中分离筛选到一株产β-葡萄糖苷酶梨头霉属（Absidia）的伞枝梨头霉菌（Lichtheimia corymbifera）菌株D8，该菌株发酵液中粗β-葡萄糖苷酶酶活为1.28 U/mL。

1.3 细菌

乳酸菌是一类能够产生乳酸的细菌，在自然界中广泛分布。在葡萄酒酿造过程中，乳酸菌可将苹果酸转化成乳酸，进行苹果酸-乳酸发酵，达到降酸的目的。与葡萄酒相关的乳酸菌包括酒球菌属（Oenococcus）、乳杆菌属（Lactobacillus）、明串珠菌属（Leuconostoc）以及片球菌属（Pediococcus）[16]。国内对葡萄酒中产β-葡萄糖苷酶的乳酸菌方面研究还比较少。杨芮[17]分析了51株葡萄酒乳酸菌产β-葡萄糖苷酶，发现51株供试乳酸菌都有β-葡萄糖苷酶活性，但酶活性大小不同。在模拟酿酒条件，酒酒球菌（Oenococcus oeni）CS-1b和短乳杆菌（Lactobacillus brevis）Lb-2酶活显著高于同类其他菌株，具有较好的葡萄酒工业化应用价值；乔慧等[18]则进一步聚焦酒酒球菌（Oenococcus oeni），在5个不同葡萄产区分离到的27株酒酒球菌（Oenococcus oeni）中都检测到了β-葡萄糖苷酶活性。李永博等[19]研究了白酒酿造微生物中β-葡萄糖苷酶，以浓香型大曲为菌源，从中分离纯化出一株高产β-葡萄糖苷酶的菌株，经16S rDNA检测，确定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

2 产β-葡萄糖苷酶酿酒微生物的遗传改造

通常情况下，从自然界中分离筛选得到的菌株，产β-葡萄糖苷酶活性有限，需进一步采用一定的育种手段，如诱变、杂交、基因工程等手段进行改造提高产酶性能，以达到生产需求。

2.1 诱变育种

诱变育种包括物理诱变和化学诱变两种，操作简单，诱变效率高，被科研工作者广泛采用。张莉等[20]以一株高产胞外β-葡萄糖苷酶的酿酒酵母MQFSM-3为出发菌株，采用3 500 μJ/cm2剂量的紫外线，辐照处理9 min，得到一株遗传稳定，酶活提高41.64%的突变菌株UV-45；徐亚男等[9]在新疆赤霞珠葡萄酒发酵过程中，筛选出一株产β-葡萄糖苷酶能力较强的克鲁维毕赤酵母（Pichia kluyveri）XYN086菌株，并采用紫外-微波复合诱变技术，使该菌株酶活提高了1.81倍；王婧[21]则以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）UV-45为出发菌株，采用化学诱变剂硫酸二乙酯（diethyl sulfate，DES）进行诱变处理，得到一株β-葡萄糖苷酶酶活为74.26 U/mL的突变菌株UV-E-16，与出发菌株UV-45相比，突变菌株UV-E-16酶活提高了22.74%，且遗传稳定。在黑曲霉诱变育种方面，刘文龙等[22]以黑曲霉AN为出发菌株，通过化学诱变剂亚硝基胍（nitrosoguanidine，NTG）处理后，获得了一株β-葡萄糖苷酶酶活高的突变株AN-17，摇瓶培养液中β-葡萄糖苷酶酶活达到291 U/mL。另外，该突变株还对葡萄糖、酸、热具有良好的耐受性；郭慧女[14]以酶活为15.3 U/mL的黑曲霉为出发菌株，利用离子束诱变技术，使得突变后菌株酶活提高了2.26倍。

2.2 原生质体融合育种

原生质体融合育种是一种特殊形式的杂交育种，与常规杂交育种相比，该技术较好地解决了一些远缘杂交不亲和的问题，扩大了杂交的范围，使更多的亲本优良性状重新组合，提高了育种效率[23]。朱凤妹[24]以β-葡萄糖苷酶酶活较高的黑曲霉3.316和米曲霉3.481为亲本，以35%聚乙二醇4000为促融剂，0.1 mmol/L氯化钙为盐桥，进行原生质体融合育种，经初筛和复筛，获得一株β-葡萄糖苷酶酶活为2.29 U/mL的融合子，该菌株酶活比亲本提高了大约30%，且遗传稳定；吴鹏[25]对产葡萄糖苷酶酒酒球菌PSY-001进行了紫外诱变和超声波诱变，并从中筛选出2株高产β-葡萄糖苷酶菌株作为亲本，通过3次细胞融合，实现了种内多次基因重组，获得了一株高产β-葡萄糖苷酶新融合菌株F3-25。该菌株的酶活比原始菌株PSY-001提高了近8倍。

2.3 基因工程育种

基因工程育种是一种在分子水平上对基因进行操作的技术，通过体外对目的基因进行重组，并导入宿主细胞进行特异性表达，从而实现对目的基因进行定向改造的目的。张阳等[26]利用锚定蛋白和转录融合伴侣的协助，成功地将黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因在酿酒酵母表面稳定展示。该方法表达的β-葡萄糖苷酶酶解葡萄汁释放的萜烯醇浓度为商业酶制剂AR2000处理所释放萜烯醇浓度的2.1倍；王亚男[27]以草酸青霉PT3-1为宿主细胞，实现了黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因的异源高效表达。首先构建了三种黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因表达盒：草酸青霉的bgl2基因启动子＋黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因、cbh1基因启动子＋黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因、PDE_02864基因启动子＋黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因。将三种表达盒依次转化至PT3-1中，使β-葡萄糖苷酶基因在宿主细胞中叠加表达，得到了一株高产β-葡萄糖苷酶菌株C3-1。发酵120 h后该菌株β-葡萄糖苷酶活力达到172.6 U/mL，比野生菌株114-2酶活提高了244倍，比出发菌株PT 3-1提高了156倍。

3 β-葡萄糖苷酶在酒类酿造中的应用

风味物质特别是挥发性风味物质的种类及含量是评价果汁、酒类等食品饮料的一种重要指标[28]。然而这些风味物质常常在水果中以稳定的前体形式存在，一旦这些前体物质被水解，芳香类配体便可释放出来[1]。β-葡萄糖苷酶可以较好的水解含β-D-葡萄糖苷键类风味物质前体，释放具有香气特性的游离糖苷配体，因而被用于食品领域的增香。果酒是一种以鲜果或果汁为原料，经过微生物发酵后得到的一种饮品[29]。因此，可通过选择合适采收期的果实，β-葡萄糖苷酶处理果汁或利用产β-葡萄糖苷酶酿酒微生物发酵果汁，从而实现果酒的增香目的。

3.1 β-葡萄糖苷酶用于酿酒原料

3.1.1 水果中β-葡萄糖苷酶表达特性

测定水果不同生长阶段β-葡萄糖苷酶酶活或酶基因的表达，掌握β-葡萄糖苷酶在水果中表达规律，可应用于选择最佳采收期的酿酒水果原料。何芒芒[30]对柑橘各个生长时期的果皮和果肉中β-葡萄糖苷酶酶活进行了测定，结果表明，随着果实的发育，果皮中β-葡萄糖苷酶酶活呈现出先增加后减小的特点，10月份的果实中酶活值最大。果肉中β-葡萄糖苷酶酶活表现出一直上升的规律，成熟期水果中酶活最大；李爱华等[31]检测了宁夏青铜峡地区转色期后不同成熟度的赤霞珠葡萄β-葡萄糖苷酶活，结果发现，赤霞珠果实中β-葡萄糖苷酶活随着果实成熟度的增加而增加，香气糖苷总量随成熟度先增加后降低；高丽[32]测定了霞多丽葡萄果皮、果肉、果梗和种子中的β-葡萄糖苷酶分布特点，p-NPG测定结果显示，霞多丽成熟的种子中β-葡萄糖苷酶活性最高，其次是果皮和果肉，果梗中的β-葡萄糖苷酶活性最低；刘翠平[33]分析威代尔不同成熟期及冰冻过程中β-葡萄糖苷酶酶解产物—萜烯类化合物的变化情况时，检测到这些具有花香和果香的萜烯类化合物随着葡萄果实的不断成熟和冰冻处理，含量变化有一定的规律性，含量最大值出现在葡萄花后140 d左右；张国军[34]利用分子生物学手段，直接检测玫瑰香葡萄成熟果实中β-葡萄糖苷酶基因VvBG1、VvBG2和VvBG3的表达值，发现三个VvBG基因表达模式不同，VvBG1和VvBG2基因的表达与果实中脱落酸（abscisic acid，ABA）积累特性一致，在果实开始成熟时表达增加迅速，在采收期时达到最大值。但VvBG3基因表达则从幼果期开始降低，一致持续到成熟期；段朝瑞等[35]进一步研究结果表明，葡萄VvBG1、VvBG2和VvBG3基因在果实不同部位表达特性不同。

3.1.2β-葡萄糖苷酶用于果汁增香

彭邦远等[36]分析了不同来源的β-葡萄糖苷酶对刺梨汁香气成分酶解效果。研究发现，刺梨汁中可以检测出以酚类和酯类为主的43种游离态风味物质，而木霉来源的β-葡萄糖苷酶酶解刺梨汁后仅释放出11种风味物质，杏仁β-葡萄糖苷酶酶解刺梨汁可释放26种风味物质，包括己醇、叶醇、茶香酮、紫罗烯等，因此杏仁β-葡萄糖苷酶酶可作为刺梨汁的酶解增香剂；高倩[37]将黑曲霉来源的β-葡萄糖苷酶用于酶解廉江红橙汁，发现酶解后红橙汁的甜度增加，苦味降低，提升了口感。在风味物质方面，β-葡萄糖苷酶处理后红橙汁的可检出香气成分由39种增加至48种，包括醇类、酸类和醛类等挥发性物质的含量均比未酶解前增加；因此，β-葡萄糖苷酶可改善红橙汁的风味，起到增香作用；王鹏等[38]采用气相色谱-质谱联用仪（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）分析了β-葡萄糖苷酶对蟠桃汁风味物质的影响，研究表明β-葡萄糖苷酶酶解后可显著提高果汁中酯类和醇类物质的含量，对蟠桃汁起到增香作用；张瑶等[39]研究发现，β-葡萄糖苷酶处理后橙汁的香气成分总量增加了11%，不但可释放新的香气物质，还可弥补果汁加工过程中损失的香气成分；郭慧女[14]将筛选的3株产β-葡萄糖苷酶菌株作用于玫瑰香葡萄汁，发现酶解有助于葡萄汁中萜烯类、醇类、酯类等令人愉快的物质的释放，且黑曲霉的作用效果最佳。因此，β-葡萄糖苷酶作用于果汁有助于其香气成分的释放，但不同的水果酶解后释放出香气种类和含量具有差异性。

3.2 β-葡萄糖苷酶用于果酒增香

刘欢等[40]研究表明，在“双优”山葡萄酒发酵过程中，添加β-葡萄糖苷酶的葡萄酒中香气成分种类和总量均高于未添加组，分别为54种和50种，184.99mg/L和124.28mg/L；桑苇等[41]将实验室筛选的产β-葡萄糖苷酶菌株用于玫瑰香酒的酿造，并考察其呈香特性。发现黑曲霉表现出较为优越的水解风味物质前体和释放香气物质的能力；王英等[42]以自行筛选的一株产β-葡萄糖苷酶的酿酒酵母用于发酵黑莓果酒，提高了黑莓果酒中花色苷的含量，因此有助于提高果酒的风味和品质；陈守文等[43]将黑曲霉来源的β-葡萄糖苷酶粗酶制剂处理干红葡萄酒，使得酒体更加鲜明、浓郁，且更易被消费者所接受；彭传涛[44]探讨了葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）的增香潜能，发现其可增强爱格丽葡萄发酵酒的感官质量和香气成分，且处理葡萄汁增香效果优于葡萄醪，野生酵母与酿酒酵母混合发酵增香效果优于纯种发酵；陶永胜等[45]继续分析了来源于葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）的β-葡萄糖苷酶对黑比诺酿酒的干红葡萄酒香气指标的影响，固相微萃取-气相色谱-质谱联用仪检测结果表明，该酶较好的水解葡萄中去甲类异戊二烯和一些萜烯类的糖苷，酒体表现出较为典型的温带水果香、花香和小浆果香的特征；卜潇[46]研究了一株产β-葡萄糖苷酶较强的植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）XJ-25在苹果酸-乳酸发酵中的增香效果，发现该菌株发酵15 d内可降酸1.1 g/L，具有增加乙醇酯类香气物质的释放的能力，增强了葡萄酒的果香和花香特征。

4 展望

β-葡萄糖苷酶因酶解底物后可释放具有香味特性产物，在食品领域得到广泛应用，一直以来也是食品领域研究的热点和重点问题之一。尽管目前β-葡萄糖苷酶在酒类酿造领域取得了一定的研究进展，但还存在一些问题仍需亟待解决。①β-葡萄糖苷酶酶解后可使多种果汁增香，但不同种类的水果酶解后释放香味物质具有一定的差异。酶的用量也需考虑，高浓度酶解，可能会生青味突出，低浓度酶解，可能增香效果不佳；②果酒酿造菌种为酵母菌，一般产β-葡萄糖苷酶能力有限。产酶性能较强的多为黑曲霉，因此，可探索基因工程方法将黑曲霉源β-葡萄糖苷酶在酵母中异源高效表达，并作为果酒酿造菌株；③多种非酿酒酵母可产生高浓度的β-葡萄糖苷酶，可与酿酒酵母混合发酵果酒，以达到果酒增香的目的，也可增加果酒的复杂度和丰富性；④在果酒发酵中，可采用固定化技术将细胞固定在特定载体上，同时结合酵母细胞高效展示技术，使细胞和酶与外界环境充分接触，以发挥最佳效果；⑤白酒因其复杂的酿酒微生物群体和复杂的酿造工艺，使得β-葡萄糖苷酶在白酒酿造中的应用受限。探索将产酶活性高的微生物菌群应用于白酒酿造中，也是一项比较有意义的工作。随着分子生物学技术和食品学科的不断发展，β-葡萄糖苷酶将会在酒类酿造中得到更广泛的应用。