SERCA2a在心力衰竭中的研究进展

李红艳, 赵思涵, 王世华, 李岩松

(西藏民族大学高原环境与疾病相关机理研究高校重点实验室，陕西 咸阳 712082)

心力衰竭(heart failure，HF)简称心衰，是各种器质性心脏病发展的终末阶段。目前由于人口老龄化和急性心脏病向慢性病的过渡，心衰发病率和经济负担呈上升趋势。动物实验发现，Ca2+稳态异常是心衰发生的普遍特征。肌质网钙离子ATP酶(sacro/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCA)是影响Ca2+循环的关键酶。近年来，关于SERCA2a在心衰中的作用，及以SERCA2a为靶点的药物治疗、基因治疗和临床研究现状等日益受到重视，本文将对这方面的研究进展作一简要综述。

1 SERCA2a结构和生物学功能

SERCA属于PIIA-ATPase亚家族，是一种跨膜蛋白，由胞质头、跨膜螺旋(含有2个Ca2+结合位点)和腔环3个区域构成，心脏中主要表达SERCA2a。SERCA2a有两种构象状态：E1(高Ca2+亲和态)和E2(低Ca2+亲和态)。兴奋-收缩偶联(excitation-contraction coupling，ECC)时，膜去极化诱导电压门控Ca2+通道打开，胞内Ca2+浓度增加，激活雷诺定受体2(ryanodine receptor 2，RyR2)开放，触发内质网(endoplasmic reticulum，ER)局部释放Ca2+，导致心肌收缩[1]。在Ca2+诱导的钙释放过程中，胞质Ca2+浓度从0.1～0.2 mol·L-1增加到2.0～10.0 mol·L-1。此时，Ca2+与SERCA2a的E1态结合，激活SERCA2a，裂解ATP，生成E1-P复合物。SERCA2a磷酸化后变为E2态。细胞质Ca2+被SERCA2a泵回ER或被细胞膜钠钙交换器(sodium-calcium exchanger，NCX)泵出细胞外，引起肌肉松弛。一旦Ca2+进入ER，SERCA2a由构象E2转化为 E1，继续摄取胞质Ca2+。SERCA2a每水解一个ATP，将两个Ca2+从细胞质泵回ER。

2 SERCA2a在心衰中的表达和调控

心衰时，SERCA2a活性或含量下降，使内质网摄取Ca2+减少，胞质中Ca2+浓度下降速度和幅度不足，延缓心肌舒张；内质网Ca2+储存量减少，心肌收缩释放Ca2+减少，心肌收缩功能下降。而SERCA2a活性或含量受内源性蛋白抑制剂、翻译后修饰、激素、小RNA(miRNA)和转录因子等调控。

2.1 PLN/PLB和SLN对SERCA2a的调控受磷蛋白(phospholamban，PLN or PLB)和肌脂蛋白 (sarcolipin，SLN)是同源内质网膜固有蛋白，分别由52和31个氨基酸残基组成。PLN主要在心肌中表达，SLN在骨骼肌中表达较多。在小鼠和人中，PLN心室比心房组织表达高。SLN在心房组织中表达高，心室只有少量表达。PLN通过降低SERCA2a对Ca2+的亲和力抑制SERCA2a活性。当胞质Ca2+浓度较低时，PLN与SERCA2a相互作用，降低SERCA2a Ca2+的表观亲和力。而Ca2+浓度较高时，由于Ca2+/钙调蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ)的激活，使苏氨酸-17 (thr17)磷酸化，缓解了PLN对SERCA2a的抑制作用。另外，蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)磷酸化PLN丝氨酸-16(Ser16)，也可减轻对SERCA2a的抑制，有利于增加心肌舒张速度[2]。Glaves等[3-5]进一步研究了PLN和SERCA2a结构间的关系，为阐明二者在钙转运中的作用提供更多依据。

1994年，Kiss等提出PLN调节SERCA2a可能存在两种方式：快速短效作用，即PLN磷酸化水平对SERCA2a活性的影响；缓慢长期作用，通过SERCA2a /PLN比率变化，控制SERCA2a表达。研究发现，SERCA2a/PLN与肌浆网Ca2+摄取以及心肌收缩力呈正相关。大鼠心衰时，PLN磷酸化，SERCA2a/PLN下降，PLN对SERCA2a抑制作用增强。而在小鼠心衰模型中发现，PKA磷酸化PLN(Ser16)介导PLN多泛素化降解，致使PLN表达下调，SERCA2a mRNA降低，而PLN mRNA无变化[6]。另外，在心衰发展不同时期，SERCA2a活性也不一样：心衰早期，代偿心肌肥厚阶段，SERCA2a活性增加；失代偿阶段，SERCA2a活性明显下降。可见，心衰中PLN对SERCA2a活性的调节机制还有待深入研究，可能与心衰的类型和阶段等因素有关。

SLN可能通过降低其与SERCA2a的表观亲和力抑制SERCA2a的活性。丝氨酸/苏氨酸激酶-16 (serine/threonine kinase-16，STK16)磷酸化SLN苏氨酸-5 (Thr-5)残基，可促进SLN与SERCA2a解离，提高SERCA2a的活性。在PLN-/-小鼠模型中发现，在给予异丙肾上腺素后，可使SLN与SERCA2a 解离，增强SERCA2a活性，促进心肌收缩。二尖瓣关闭不全手术患者的左心室组织中，SLN mRNA和蛋白水平升高12～16倍。可见，SLN负调节SERCA2a活性影响心功能。但有关心衰中SLN对SERCA2a的直接调控还未见报道。

2.2 翻译后修饰对SERCA2a的调控翻译后修饰包括糖基化、乙酰化、硝化、泛素化和甲基化等，可以直接调节SERCA2a表达。O-连接的-N-乙酰葡糖胺糖基化修饰(O-linked N-acetylglucosaminylation，O-GlcNAcylation)可以修饰SERCA2a蛋白表达，影响Ca2+转运。糖尿病中O-GlcNAcylation表达增加引起SERCA2a蛋白水平下降，导致Ca2+舒张延长。腺病毒(adenovirus, AV)过表达O-GlycNAcase可降低O-GlcNAcylation表达，使总PLN蛋白降低，但升高了PLN磷酸化水平。可见，O-GlcNAcylation通过直接影响SERCA2a或者PLN磷酸化调控SERCA2a表达。糖基化在心衰中的作用还有待研究。

SERCA2a泛素化主要通过1型小分子泛素样修饰蛋白(small ubiquitin like modifier，SUMO1)结合在SERCA2a赖氨酸480和赖氨酸585残基上完成。心衰时总SUMO1减少，SERCA2a泛素化水平降低。在压力超负荷心脏组织中注射SUMO1可提高心功能及SERCA2a活性。但干扰SUMO1表达后，SERCA2a蛋白水平降低，加重了压力超负荷导致的心功能恶化。可见，SERCA2a泛素化对心脏有保护作用。

衰竭心脏中SERCA2a乙酰化水平升高，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖的去乙酰化酶1(NAD-dependent protein deacetylase sirtuin-1，SIRT1)可逆转该过程。表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)是茶多酚中的活性成分，可提高SERCA2a乙酰化修饰，从而抑制压力过负荷诱导的心衰[7]。另外，人心衰中SERCA2a硝化表达增加。已知在扩张性心肌病SERCA2a硝化水平升高约2倍；糖尿病大鼠心脏中SERCA2a的硝基酪氨酸水平翻倍。并进一步证实，SERCA2a硝化是通过多元醇通路引起的。

赵翠萍等[8]发现心梗后心衰大鼠SERCA2a甲基化水平升高，而甲基化抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-dC)可减轻心衰程度。TNF-α通过促使SERCA2a启动子区甲基化抑制SERCA2a基因表达，致使SERCA2a mRNA及其蛋白表达下降，促进心衰。另外发现，肼屈嗪可诱导心肌细胞SERCA2a启动子区去甲基化，而三氯乙烯可诱导SERCA2a启动子区甲基化。因此，对SERCA2a的DNA甲基化进行干预有望成为治疗心衰的一个新方向和新靶点。

2.3 激素对SERCA2a的调控在胰岛素治疗大鼠糖尿病中发现，早期SERCA2a/PLN比值升高，心肌舒张速度增快，并且可能是通过PI3-kinase-Akt-SERCA2a信号通路引起SERCA2a水平增高的。O-(3-哌啶子基-2-羟基丙基)-烟碱偕胺肟(O-[3-piperidino-2-hydroxy-1-propyl]-nicotinic amidoxime，BGP-15)是一种新型的胰岛素增敏剂，可通过影响SERCA2a/PLN通路，增强心肌舒张功能[9]。在心肌缺血/再灌注损伤中，胰岛素以AKT依赖和SERCA2a介导的方式恢复心肌细胞收缩功能。甲状腺激素(thyroid hormone，TH)异常与心衰紧密相关，而TH是SERCA2a转录水平上的重要调控因子。心肌细胞中注射TH可使SERCA2a mRNA增高。甲状腺功能亢进常引起SERCA2a mRNA和蛋白升高，PLN mRNA和蛋白降低。而甲状腺功能减退中SERCA2a mRNA和蛋白减少，PLN mRNA和蛋白上升。同时，甲状腺功能减退症患者中，促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)水平升高。TSH通过与心肌细胞膜TSH受体结合，抑制PKA/PLN信号通路，抑制SERCA2a的活性和表达，从而导致心脏舒张和收缩功能障碍。脂联素是一种脂肪细胞来源的肽激素，通过促进SERCA2a活性，起到保护心脏的作用。在心肌缺血-再灌注模型中，静脉注射脂联素可使SERCA2a活性恢复到基础水平。在H9C2细胞中加脂联素培养1h后，SERCA2a mRNA表达量增加。有关胰岛素、TH、TSH和脂联素在心衰中调控SERCA2a表达的具体机制还有待进一步研究。

2.4 转录因子对SERCA2a的调控研究发现，心肌SERCA2a mRNA的表达与线粒体转录因子A (mitochondrial transcription factor A，TFAM)和B2 (TFB2M)的表达显著相关。TFAM和TFB2M分别通过与SERCA2a基因-122～-114和-122～-117启动子区结合调控心脏SERCA2a转录。在新生大鼠心肌细胞中发现，过表达TFAM和TFB2M使SERCA2a转录活性提高2倍。在糖尿病心脏和心肌梗死后心衰中，TFAM表达下调。另外，SERCA2a基因近端(-284 bp～-80 bp)启动子区有7个与转录因子SP1结合的位点。SP1蛋白在压力诱导过载心脏中引起SERCA2a mRNA下降。而有关TFAM、TFB2M和SP1在心衰中的调控机制还不明确。

2.5 其它miRNAs是一类调节转录后基因表达和蛋白翻译的小非编码RNA分子。在SERCA2a的3’未翻译区域有miRNA识别位点。心衰中通过腺病毒介导miRNA-25过表达，SERCA2a蛋白含量下降。而在野生型小鼠体内注射miRNA-25反义寡核苷酸，可增加SERCA2a蛋白表达。另外，miRNA-22-/-小鼠与野生型小鼠相比，延长细胞质Ca2+衰退，使ER Ca2+负荷降低。肽基脯氨酰顺反异构酶(peptidyl-prolyl cis/trans isomerase，PPIase)家族中的Pin1是心肌肥厚发育和心肌祖细胞周期的重要调节因子。Pin1活性降低与SERCA2a和NCX1蛋白水平增加相关。在心肌细胞内，Pin1可能通过与SERCA2a和NCX1蛋白相互作用调控Ca2+循环[10]。Pin1在心衰中的作用还有待研究。另外，心衰中抑制CaMKIIA表达，降低了RyR2表达，而SERCA2a表达上调，从而提高心功能[11]。B型钠尿肽(b-type natriuretic peptide，BNP)是一种由心室肌细胞分泌的能够反映心脏功能的激素，目前被用做心衰的一个定量标志物。心衰中发现，BNP可能通过抑制SERCA2a基因转录而降低SERCA2a基因转移的疗效[12]。心脏收缩力调制术(cardiac contractility modulation，CCM)是通过在心室绝对不应期给予电流刺激实现心衰治疗的一种新方法，旨在改善左室收缩功能。在兔主动脉缩窄性心衰模型中发现，CCM通过抑制miR-25表达，促使SERCA2A表达增加，从而改善左心室收缩功能[13]。由此可见，miRNA-25、Pin1、CaMKIIA、BNP和CCM等在以SERCA2a靶向治疗心衰中可能都发挥着一定作用，具体机制还有待深入研究。

3 SERCA2a是治疗心力衰竭的有效靶点

3.1 通过干预PLN表达或磷酸化间接调控SERCA2a表达已知，PLN有降低SERCA2a对Ca2+的亲和力，从而抑制SERCA2a活性的作用。因此，降低PLN或增加PLN磷酸化可能成为增加SERCA2a活性治疗心衰的有效方法。研究发现，删除PLN基因可增强SERCA2a功能，避免大鼠发生心室衰竭；仓鼠心衰模型中用重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)介导人PLN (S16E)磷酸化突变体可增强内质网Ca2+摄取并恢复心脏功能；AV转移PLN假磷酸化突变体(AdS16E)可逆转羊心衰的发展。另外，PLN功能缺失突变体表现出与SERCA2a高亲和力。PLN抑制剂PP1 (protein phosphatase 1)已被广泛用于改善内质网Ca2+的摄取。在心衰猪冠状动脉内通过腺相关病毒-9 (adeno-associated virus 9，AAV9)输注I-1c(内源性PP1抑制剂)可减少心肌梗死疤痕大小。PP1抑制剂 Calyculin A也具有正性肌力作用，与其激活SERCA2a活性有关[14]。

3.2 药物干预调控SERCA2a表达在心衰治疗中，目前已出现了一系列通过调控SERCA2a表达、改善心肌收缩力的中药和化学合成药。中药如芪参颗粒，通过上调SERCA2a表达和活性、降低RyR2过度磷酸化、抑制PKA表达、上调PP1转录等方式减轻心衰大鼠心室重构[15]；木犀草素是一种广泛存在于中草药中的黄酮类化合物，通过靶向SERCA2a 泛素化和PI3K/akt通路参与心衰调节[16]；益气活血方药以调节心衰大鼠肌组织中 SERCA2a和IP3R mRNA的表达，改善心脏功能[17]。另外，心痛方、氧化苦参碱、补阳还五汤、黄芪、黄芪多糖、丹酚酸B和丹参等在治疗心衰中也都以直接或间接调控SERCA2a表达或活性的方式改善心功能。

化学合成药如伊思托赛(istaroxime)，SERCA2a的激动剂，在心衰中主要通过将PLN从SERCA2a/PLN复合物中取代下来，解除PLN对SERCA2a的抑制作用，从而加速Ca2+循环；吡啶酮衍生物(pyridone derivative)作用方式与伊思托赛类似[18]；喹诺胺化合物CDN1163是SERCA2a的一种变构激活因子，可直接与SERCA2a结合，减轻内质网应激[19]。比索洛尔、2,5-二羟甲基-3,6-二甲基吡嗪(liguzinediol)、缬沙坦、辛伐他汀、美托洛尔和氯沙坦等药物均是通过提高SERCA2a活性，在心衰治疗中发挥正性肌力作用。

3.3 SERCA2a基因治疗临床现状SERCA2a表达和活性下降是心衰的一个重要特征，因此，通过转基因上调 SERCA2a表达或提高其活性成为治疗心衰的一项策略。AV和AAV是心血管疾病中最常用的载体。虽然应用AV转载SERCA2a在心衰治疗中已经取得了一些成绩，但是AV介导的转基因表达有短暂性和高度免疫原性缺陷。因此，目前多采用AAV载体介导转基因表达，其免疫原性低，转染效率高，并且在以SERCA2a为靶点的动物心衰治疗中取得了显著疗效。

在临床上，2007年，由美国发起了第一期心衰转基因治疗，旨在评价AAV1-SERCA2a基因治疗对晚期心衰患者的安全性及生物学疗效，取得了较好效果。紧接着进行了二期临床试验。二期临床中发现，只有一小部分人心肌细胞表达了AAV1-SERCA2a。同时，相当一部分人中存在中和抗体(neutralizing antibodies，NAbs)，从而抑制AAVs载体在心肌中的吸收效率。这可能是由于AAVs载体中可插入目的基因的容量相对较小。另外，尽管两期研究中用于测定的单链DNA剂量是相同的，但一期临床较二期中用的载体含有较多空病毒衣壳。有证据表明，空病毒衣壳可以降低病人血清中NAbs含量。另外，二期患者采用的是顺行冠脉给药，该给药方法的缺点是载体容易进入血液循环，随血液循环可被带到其他器官，所以降低了靶器官的吸收效率[20]。因此，就目前转导率低的问题，有科学家提出未来研究应专注于发展基因转导技术，以改进基因传递方法，开发更有效的载体系统，并控制中和抗体的影响[21]。

4 总结与展望

综上所述，SERCA2a表达或功能异常直接影响着细胞内Ca2+循环，进而影响心肌收缩活动，成为引发心衰的一个关键因素。通过干预PLN或SLN表达，影响SERCA2a翻译后修饰、激素水平和相关转录因子表达，以及药物和基因治疗等方法增加SERCA2a含量或活性，即或提高SERCA2a/PLN比值的方法都将成为治疗心衰的可行策略。而在以SERCA2a靶向基因治疗中存在两个问题有待解决：转导效率低和NAbs的出现。希望随着SERCA2a在心衰研究中的深入，有更多替代治疗方法的出现，如使用诱导多能干细胞移植或获得新生心肌细胞，这样可能会使患者长期获益。

(致谢：本文是在西藏民族大学高原环境与疾病相关机理研究高校重点实验室完成的。)