抑制MicroRNA-27b调控Nrf2/ARE信号通路对高血压性脑出血大鼠模型脑损伤的机制研究

刘小江， 李 军， 管义祥

(江苏省海安市人民医院神经外科， 江苏 海安 226600)

脑出血是临床上的危急重症之一，发病占脑卒中的10%～30%，具有高发病率、高死亡率和低治愈率的特点[1]。高血压性脑出血(hypertensive intracerebral hemorrhage，HICH)是由于高血压常导致脑内小动脉血管壁上发生玻璃样或纤维样病变，进而引起已病变的动脉破裂出血所致，约占自发性脑出血的70%～80%[2]。HICH发生后，血管破裂出血会引发血肿压迫病灶周围脑组织，继发脑水肿，导致神经细胞受损，诱发脑部炎症变化，激活神经细胞凋亡，并最终引起继发性脑组织损伤。目前，手术清除血肿可缓解周围脑组织的机械性压迫，但是针对出血引起的继发性脑损伤仍缺乏有效治疗手段。MicroRNAs(miRs)是一类由内源基因编码、长度在19～25个核苷酸的小RNA[3]。MiRs与靶标mRNA的3'-UTR区结合，可以降解或抑制靶向mRNA的翻译，抑制转录后水平的蛋白质表达，参与调节细胞的生长、分化、代谢、增殖和凋亡。MiR-27b是miR-27家族的一个亚型。近年来众多研究表明，miR-27b具有响应生物体氧化应激(oxidative stress，OS)反应的功能，并参与Ⅱ型糖尿病、神经胶质瘤、胃癌等多种疾病的发生、发展[4]。Nrf2/ARE信号通路是生物体内最重要的抗氧化信号通路，可被外界各种OS所诱导，通过活化后的转录因子核因子相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)与其DNA结合序列antioxidant response element(ARE)结合并激发下游靶基因的表达。这些靶基因主要包括血红素加氧酶(heme oxygenase 1，HO-1)、醌氧化还原酶1(quinone oxidoreductase 1，Nqo1)和甘肽过氧化酶1(glutathione peroxidase，Gpx1)等[5]。目前miR-27b与HICH之间的关系缺乏相关报道，Nrf2/ARE信号通路在HICH中的表达变化也尚未明确。因此，本研究拟通过调控miR-27b在HICH大鼠中的表达，分析miR-27b对Nrf2/ARE信号通路关键蛋白以及HICH的影响，探讨寻找治疗HICH的药物新靶点的可能性。

1 材料与方法

1.1动物分组:普通级健康雄性Wistar大鼠60只，体重220～270g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供。随机分为以下4组，Sharm组、HICH组、HICH-NC组和HICH- antagomir组，每组各45只。

1.2HICH大鼠模型的制备:首先采用双侧肾动脉前支部分热凝、高盐高脂高胆固醇饮食饲养6周后建立大鼠高血压模型，期间每周用RBP-1B型大鼠血压计行尾部血压测量1次。在上述高血压模型基础上，采用立体定位仪下自体血脑内注入法建立高血压脑出血模型。具体步骤为：用100g/L水合氯醛350mg/kg体质量腹腔内注射麻醉大鼠，腹位固定于定向仪上，顶部剃毛消毒后正中矢状位切开，在前囟后0.2mm，右旁开3.0mm处行颅骨钻，用50℃温水加温鼠尾，断尾取血100μL，在立体定向仪下进针6.0mm(相当于尾壳核部)，3min内将50μL血注入大鼠脑内(相当于人脑出血40mL)，留针10min后退出，缝合头皮。Sharm组采用脑出血模型制备同种方法，但进针后不注血，注入50μL生理盐水代替自体血。HICH大鼠前3d，HICH组、HICH-NC组和HICH- antagomir组分别将5μL生理盐水、5μL(20nmoL/L)拮抗剂阴性对照、5μL(20nmoL/L)miR-27b拮抗剂注入大鼠右侧脑室，具体坐标为前卤后1.5mm，中线右侧旁开1.1mm，立体定位仪下进针4.5mm。miR-27b拮抗剂购自Ribobio(China)。Sharm组采用同种方法，注入等量生理盐水。

1.3qRT-PCR检测miR-27b、Nrf2基因表达:分别在造模后的第6h、12h、24h、48h和72h，采用qRT-PCR检测HICH组大鼠和Sharm组大鼠miR-27b及Nrf2 mRNA水平。取大鼠出血部位纹状体脑组织，Trizol法(Invitrogen，USA)提取总RNA。miR-27b mRNA 5'-3'端引物序列为TTCACAGTGGCTAAGTTCTGC；Nrf2 mRNA 5'-3'端引物序列为TTTGTAGATGACCATGAGTCGC，3'-5'端引物序列为TGTCCTGCTGTATGCTGCTT。按照反转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara，Japan)和Mir-XTMmiRNA First Strand Synthesis Kit(Takara，Japan)分别合成cDNA。以cDNA为模板，按照荧光定量PCR试剂盒TB Green Premix Ex Taq (Takara，Japan)说明书步骤进行qRT-PCR实验，miR-27b mRNA 3'-5'端引物为试剂盒常用引物。2-ΔΔct进行数据定量分析。

1.4Western Blot检测Nrf2、HO-1和Nqo1蛋白质表达:取大鼠纹状体脑组织，加入RIPA细胞裂解液(Beyotime，China)，4℃下制备组织匀浆。BCA试剂盒(Beyotime，China)测定蛋白浓度，根据所测蛋白浓度计算上样体积。10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，PVDF转膜。5%脱脂牛奶室温封闭1h，分别加一抗Nrf2(1:1000，Abcam，UK)、HO-1(1:10000，Abcam，UK)、Nqo1(1:1000，Abcam，UK)及β-actin(1:1000)4℃孵育过夜。第2天加二抗室温孵育2h，TBST洗膜后，GE Amersham Imager 600显影成像，ImageJ软件定量分析各组蛋白表达差异，以β-actin为内参，进行蛋白表达相对定量计算。

1.5SOD、TNF-α和IL-1β水平检测:在给药造模后的24h，处死大鼠，出血部位提取脑组织制备10%组织匀浆，离心10min。SOD检测采用黄嘌呤氧化法，严格按照试剂盒说明书进行各项操作内容，试剂盒采购自南京建成生物工程研究所。TNF-α和IL-1β检测采用Elisa，试剂盒购自Bio-Rad(USA)，操作按照试剂盒说明书进行。

1.6TUNEL法流式细胞分析法检测神经组织细胞凋亡:采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法(TUNEL)进行细胞凋亡检测，实验过程根据试剂盒(Roche，US)要求操作，使用Image-pro plus系统分析在光学显微镜(每组选择5个随机的视野，400X放大率)下观察到的阳性细胞数。流式细胞分析法取各组新鲜脑组织4℃研磨制成组织匀浆，筛网过滤后加入PBS溶液配成细胞悬液，1000 rpm离心5 min，用PBS缓冲液洗涤上清液细胞。之后1000rpm再次离心5min，向沉淀中加入500μL膜联蛋白结合缓冲液，吹打混匀，加入5μL的Annexin V- FITC试剂常温避光静置10min，加入10μL PI试剂室温下避光孵育5min。流式细胞仪检测各组细胞的荧光强度，分析细胞凋亡百分率。

2 结 果

2.1HICH大鼠miR-27b和Nrf2 mRNA水平的变化:与Sham组比较，miR-27b表达量在HICH后6 h显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05),并在24 h达到最低水平(P<0.05)，随后miR-27b水平开始上升，在72 h逐渐恢复至正常水平(P>0.05)。同时，Nrf2 mRNA水平也呈现出时间依赖性变化。在HICH后的6h，Nrf2 mRNA水平显著升高(P<0.05)，并在24 h 达到最高水平(P<0.05)，随后Nrf2 mRNA表达量开始下降，在72 h后逐渐恢复至正常水平(图1)。这些结果表明miR-27b与Nrf2信号通路之间存在明显的负相关性。

图1 不同时间点HICH大鼠miR-27b和Nrf2 mRNA表达情况。*表示与Sharm组比较

2.2miR-27b拮抗剂诱导HICH大鼠Nrf2/ARE信号通路Nrf2、HO-1、Nqo1表达激活:为进一步探究miR-27b与Nrf2/ARE信号通路之间的关系，我们通过侧脑室注射miR-27b拮抗剂，测定Nrf2/ARE下游蛋白的表达情况。结果见图2。与Sharm组相比，HICH组Nrf2、HO-1、Nqo1蛋白表达量显著提高(P<0.05)，而注射miR-27b拮抗剂的HICH-antagomir组Nrf2、HO-1、Nqo1表达与HICH组相比，表达量则进一步提高，差异具有统计学意义(P<0.05)。表明miR-27b拮抗剂可以进一步激活Nrf2/ARE下游抗氧化蛋白的表达。

图2 miR-27b拮抗剂促进Nrf2/ARE信号通路下游蛋白表达。*表示与Sharm组相比；#表示与HICH组相比

2.3miR-27b拮抗剂对HICH大鼠脑组织氧化损伤和神经炎症的作用:进一步验证miR-27b拮抗剂对HICH诱导的OS的影响，如图3所示。与HICH组比较，HICH-antagomir组SOD水平显著提高，TNF-α和IL-1β水平则显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。表明miR-27b拮抗剂有效缓解了HICH对大鼠脑组织造成的氧化损伤以及神经炎症。

图3 miR-27b拮抗剂缓解HICH大鼠脑组织氧化损伤和神经炎症。*表示与Sharm组相比；#表示与HICH组相比

2.4miR-27b拮抗剂缓解HICH大鼠脑组织神经细胞凋亡:为了检测miR-27b拮抗剂对HICH大鼠脑组织神经细胞凋亡的影响(图4)。分析各组实验结果，HICH组阳性细胞比率比Sham组显著提高(58.85±6.89% vs. 8.79±1.52%)，差异具有显著性(P<0.01)。HICH-antagomir组与HICH组比较，TUNEL阳性比率则显著降低(29.52±3.69% vs. 58.85±6.89%)，差异具有显著性(P<0.05)。流式细胞图显示Sham组细胞凋亡率3.06%；HICH细胞凋亡率50.00%；HICH-NC组细胞凋亡率36.58%；HICH-antagomir组细胞凋亡率12.2%。这些结果表明miR-27b拮抗剂对HICH大鼠脑组织神经细胞凋亡具有一定的缓解效果。

图4 TUNEL法和流式细胞分析法检测神经细胞凋亡。*表示与Sharm组相比；#表示与HICH组相比

3 讨 论

在脑实质中HICH造成血液成分发生崩解，进而引发大量活性氧组(reactive oxygen species，ROS)释放，诱发OS，造成脂质、DNA、蛋白质等发生氧化损伤以及神经炎症，最终导致神经细胞凋亡，是造成继发性脑损伤的主要原因。本研究发现，在HICH大鼠模型中抑制miR-27b的表达，能够有效缓解HICH造成的氧化损伤以及神经炎症，对HICH导致的继发性脑损伤具有保护作用。有研究表明，抑制miR-27b可能与Nrf2/ARE信号通路的激活有关，这与我们的研究结果一致[6]。

最近的一些研究表明，生物体内的OS可以通过影响miRs装配成熟的关键分子来调节miR的生物学功能，同时miRs本身也可以被OS调节，从而改变miRs的完整性、稳定性和生物学功能[7]。目前有多种miR通过抗氧化途径参与到对OS的细胞应答。MiR-27b是一类与OS有关的miRs，在生物体内受到氧化刺激后，miR-27b表达被明显抑制[8]。在本研究中，HICH大鼠脑内的miR-27b表达量在造模后发生了明显下降，说明HICH大鼠脑内可能产生大量OS。检测SOD、TNF-α和IL-1β水平发现，SOD水平与Sham组相比显著降低，同时TNF-α和IL-1β水平则显著上升。进一步验证了HICH大鼠脑内发生严重的OS和神经炎症反应。Nrf2是维持细胞内氧化还原稳态的关键调节因子，是miR-27b的潜在靶标分子。HICH模型大鼠中进行的miR-27b和Nrf2 mRNA表达研究结果显示，miR-27b的下调的同时，大鼠的Nrf2 mRNA表达显著上调，说明miR-27b和Nrf2表达之间可能存在负相关性。鉴于Nrf2在大鼠HICH模型中的神经保护作用以及Nrf2与miR-27b之间潜在的相互作用，我们认为miR-27b表达的下调可被视为对HICH的保护性应答机制。

生物体内，SOD具有清除自由基和阻断自由基触发的脂质过氧化反应及细胞损伤的作用[9]。TNF-α和IL-1β则是NF-kB表达的下游响应因子，是参与生物体炎症反应的重要因子[10]。HICH模型大鼠侧脑室注射给药miR-27b拮抗剂，抑制miR-27b的表达发现，miR-27b表达量降低会激活Nrf2/ARE下游靶标蛋白HO-1、Nqo1的表达，使HICH大鼠脑组织内的SOD水平逐渐恢复至正常状态，TNF-α和IL-1β水平同时也会显著降低。表明miR-27b表达降低能够激活Nrf2/ARE信号通路，有效缓解HICH模型大鼠体内的氧化损伤和神经炎症。MiR-27b拮抗剂的使用同时也大幅度降低了脑组织内神经细胞的凋亡。这些结果提示，通过抑制miR-27b的表达，激活Nrf2/ARE信号通路，对于HICH模型大鼠的脑损伤具有一定的疗效，这为进一步研发HICH药物提供了理论基础。