卵泡液中抗精子抗体的检测及对受精能力的评估

马文叶，金 锐，康卉娴，代 良，唐大伟，白 刚，刘 芳，任萌萌，包俊华

不孕不育症患者中有10%～30%为抗精子抗体(AsAb)等免疫因素导致的不孕[1-2]。女性体内的AsAb是机体对精子抗原产生的同种异体免疫反应的产物，普遍存在于不育症患者的卵泡液、血清及精液中，可阻碍精子与透明带以及卵膜接触，降低受精率。在体外受精/卵胞浆内单精子注射(IVF/ICSI-ET)的治疗过程中，有10%～20%的周期会发生受精完全失败[3]，及早发现患者的受精能力是实施早期补救ICSI的关键。通过检测卵泡液中AsAb的阳性率，及早预警患者受精失败的可能性，以帮助胚胎培养室人员适时实施RICSI。

1 资料与方法

1.1 一般资料：回顾性分析我院2017年9月-2018年5月因输卵管因素助孕的患者194例，符合纳入标准患者141例。按不孕原因分为：原发不孕组70例，继发不孕组71例。按受精方式分为：A组，即常规IVF组，共89例；B组，即前次受精失败改行ICSI组，共32例；C组，即IVF短时受精完全失败行RICSI组，共20例。纳入标准：①年龄≤35岁；②首次接受IVF -ET助孕治疗；③因IVF受精失败首次改为ICSI再次助孕治疗者；④获卵数目在10～15个。排除标准：①取卵当日因精液问题临时改为ICSI；②采用供精实施IVF-ET的患者。

1.2 促排卵方案及受精观察：均采用高孕激素状态下促排卵方案(PPOS)或卵泡期长方案，当目标卵泡有2个≥20 mm时，且≥16 mm占≥14 mm的卵泡数目比大于60%时，注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)5 000～10 000后36～38 h，在B超引导下经阴道取卵。hCG注射后39～40 h按精子/卵母细胞的比例加入经处理优化后的精子，受精4～6 h后拆去卵母细胞周围的颗粒细胞，于倒置显微镜下观察极体及卵母细胞胞浆情况。明确第二极体出现率小于50%，对所有明确单极体成熟的MII卵子实施RICSI。

1.3 研究方法：取卵当日留取无血污染的卵泡液，离心取上清液2 mL于-20 ℃冰箱中保存待测。AsAb抗体检测试剂盒由潍坊市康华生物技术有限公司提供，采用ELISA法。实验操作、结果阴性和阳性判断均严格按照试剂说明书。

2 结果

2.1 原发与继发不孕患者一般资料比较:原发与继发不孕患者不孕年限、Gn总量、Gn天数、获卵数、成熟率、受精率、正常受精率和卵裂率差异无统计学意义(P>0.05),见表1。

表1 原发不孕与继发不孕患者临床一般资料的比较

2.2 3组患者一般情况比较：A组、B组、C组的年龄、不孕年限、Gn总量、Gn天数、获卵数和卵裂率差异无统计学意义(P>0.05),见表2。

表2 3组患者一般情况的比较

2.3 原发与继发不孕组早期补救率、卵泡液AsAb阳性率比较:原发不孕组早期补救率为21.43%，继发不孕组为7.04%；原发不孕组AsAb阳性率为28.57%，继发不孕组为9.86%，2组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，原发不孕组患者的早期补救率和卵泡液AsAb阳性率显著高于继发不孕组，见表3。

表3 2组不孕患者卵泡液AsAb阳性率的比较[n(%)]

2.4 3组患者正常受精率、AsAb阳性率比较：A组、B组、C组的正常受精率(52.53%，69.23%与68.57%，P<0.05)和AsAb阳性率(15.73%，34.38%与10.00%，P<0.05)差异有统计学意义，其中B组和C组的正常受精率显著高于A组，且B组的AsAb阳性率最高，见表4。

表4 3组患者正常受精率、AsAb阳性率的比较[n(%)]

3 讨论

IVF-ET技术在近30年来的广泛应用帮助众多不孕夫妇完成做父母的梦想，但是仍有30%左右的患者在实施常规体外受精时出现受精失败，导致患者没有可利用的胚胎，无法移植，给本人和家庭造成经济和心理的双重打击。而早期补救ICSI 技术[4-5]的出现很好地弥补了部分常规体外受精发生受精失败的不良结局，减少了因无可移植胚胎对患者造成的不利影响。

但是，目前胚胎实验室主要以分析观察受精后排出第二极体卵母细胞的比例来决定是否对患者实施补救ICSI,条件较为单一。由于卵母细胞成熟发育不同步，在受精6 h后仍有8%左右的卵子推迟了第二极体的排出时间；另外当第一极体出现碎片或分裂时很难与第二极体进行区分[6],往往造成对卵母细胞受精情况的误判，失去或者延误了实施早期补救ICSI的最佳时机，仍然会造成一部分患者没有可利用胚胎的不良结局。所以，探寻更多的评估患者受精能力的指标就成为目前胚胎培养工作人员研究的难点。

常规体外受精失败的原因可能有：精卵成熟不良，精子与卵子透明带结合障碍，配子融合障碍等[7-9]。AsAb广泛存在于人体的血液和体液中，卵泡液中也可以检测到AsAb。AsAb主要通过以下机制影响精子与卵子结合：①抑制精子顶体酶的活性，从而抑制顶体反应的发生；②抑制精子对透明带的附着与穿透，使精子不能穿过透明带。本研究结果显示，原发不孕组的早期补救率和AsAb阳性率与继发不孕组比较有显著性差异，2组的AsAb阳性率均符合资料报道的10%～30%不孕患者中可检测出AsAb。AsAb阳性率在原发不孕症患者中具有较高比例，说明AsAb可能是原发不孕患者导致受精失败的原因之一。

本研究通过对不同受精方式的A组、B组和C组患者卵泡液中AsAb的检测，评估AsAb对受精能力的影响，结果显示A组、B组、C组的正常受精率和AsAb阳性率有显著性差异。其中B组和C组的正常受精率显著高于A组，且B组的AsAb阳性率最高，原因是这组患者前一周期受精失败行RICSI，这一周期直接做ICSI。结果表明，卵泡液中的AsAb阳性率对原发不孕患者早期补救ICSI的操作具有一定的预测价值。

我院于IVF加精后4～6 h拆除卵周颗粒细胞，观察第二极体排出情况及卵胞浆形态学的改变，未观察到明确第二极体或明确第二极体比率低于50%，对所有明确单极体且胞浆无形态学改变的卵子及时行RICSI。而对存在碎片样极体的卵子是否应及时行RICSI决定较慎重，根据极体的碎片分布及间隔1～2 h后再次观察碎片的大小、形态、位置是否改变，并结合胞浆的皮质反应情况及原核出现情况，综合判断卵母细胞是否受精。因此有必要进一步通过定性检测体外受精患者取卵后卵泡液中AsAb阳性情况，联合对胚胎形态学的观察，帮助胚胎培养室人员尽早发现受精失败患者，对受精异常者有更及时、更准确的评估。本研究的患者样本量较少，仍需要扩大样本量进一步研究，为选择一个相对更安全、更有效的受精方式，降低受精失败、取消周期的风险，提高治疗的成功率提供更多的临床研究数据。