MEX3C基因缺失对小鼠产仔数和卵泡发育的影响

杨玲玲，马会明，赵 帅，杨张杰，虎 娜，徐 仙

MEX3C(MEX-3 RNA binding family member C)是RNA结合蛋白家族的成员，在C-端有一个E3泛素连接酶活性的锌指结构域[1-2]。E3泛素连接酶在细胞周期变化、细胞增殖和细胞凋亡过程中发挥关键作用[3]，MEX3C基因敲除则沉默或抑制这些酶的活性，可抑制细胞增殖，并促进细胞凋亡，导致发育异常。已有研究证明，MEX3C在生物学过程中介导转录后调控，可导致遗传易感性高血压[4]，是癌细胞中染色体不稳定性(CIN)抑制剂[5]，可增加能量消耗，减少脂肪沉积[6-7]。已报道染色体不稳定的细胞显示细胞分裂后期染色体错误分离[8]，MEX3C基因敲除降低了细胞质DNA的自主反应，进而增加了染色体错误分离的比例，形成染色体非整倍体,可能导致不育不孕、自发流产和先天出生缺陷等异常[9]。MEX3C在许多组织中广泛表达，在细胞的发育、分化、凋亡等生理病理过程中发挥作用，因此，本研究利用MEX3C 基因敲除小鼠作为研究对象，从整体水平探讨MEX3C基因缺失对小鼠产仔数、卵泡发育的影响，进而明确是否影响小鼠的繁殖，有望为临床卵巢功能的改善提供药物靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料：6周龄的FVB小鼠购自赛业(苏州)实验动物有限公司，雌雄各3只，体质量(16.02±0.35)g，基因型为杂合体(MEX3C+/-),实验动物许可证为NTCMK170902CHK01。按雌∶雄=1∶1配对繁殖，室内温度控制在20～25 ℃,湿度控制在 50%～60%,光照周期12 h，通风良好，自由进食饮水，每周换垫料2次，小鼠饲养于宁夏医科大学SFP级动物中心研究所。主要试剂与仪器：DNA提取试剂盒、2×Taq PCR Master、D2000、6×DNA Loading Buffer 均购自TIANGEN;琼脂糖粉、引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司；HE试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；倒置荧光显微镜购自德国 LEICA 公司。

1.2 方法

1.2.1 MEX3C小鼠基因型鉴定：采用PCR法。剪取6～8周龄小鼠尾巴，提取DNA，体系如下。总体积(25 μl)：Premix Taq 12.5 μl，上游及下游引物各1 μl，模板 DNA 2 μl，ddH2O 8.5 μl。PCR循环参数：94 ℃预变性3 min； 94 ℃变性30 s，52 ℃退火35 s，72 ℃延伸35 s，35个循环；72 ℃延伸5 min，最后4 ℃保存备用。引物见表1。

表1 MEX3C基因敲除小鼠引物序列

1.2.2 繁殖性能的测定：将鉴定出的雌性小鼠分为MEX3C+/-组和MEX3C+/+组，于6周时分别与MEX3C+/-雄鼠采用1∶1合笼，每组6对，观察各组小鼠每一代的平均窝产仔数及子代数。

1.2.3 苏木精-伊红(HE)染色观察卵巢组织形态：6周龄小鼠卵巢组织依照实验室[10-11]常规方法，行酒精梯度脱水透明，石蜡包埋，切片厚度5 μm，苏木精-伊红染色，显微镜下观察卵巢组织形态，并拍照。

2 结果

2.1 MEX3C小鼠基因鉴定：1.5%的琼脂糖凝胶电泳显示MEX3C+/+PCR扩增条带为499 bp，MEX3C+/-扩增条带为640 bp、499 bp，MEX3C-/-扩增条带为640 bp，见图1(目录后)。

2.2 MEX3C小鼠繁殖情况：MEX3C+/-雄鼠与MEX3C+/-雌鼠交配平均每代窝产仔数均小于MEX3C+/-雄鼠与MEX3C+/+雌鼠交配的窝产仔数，且相同时间段内子代数也减少,差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.3 HE染色观察卵巢组织形态和卵泡计数(X20)：野生型组可见各级卵泡，杂合子组可见多个闭锁卵泡，见图2(目录后)。

杂合子组原始卵泡计数和初级卵泡计数均小于野生型组，闭锁卵泡计数大于杂合子组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3 。

表2 每一代平均的窝产仔数

表3 2组小鼠卵泡计数

3 讨论

MEX3C(MEX-3 RNA binding family member C)是一种有两个KH结构域的RNA结合蛋白，其有4种同源物：MEX3A、MEX3B、MEX3C和MEX3D，它们分别定位于人类1号、15号、18号、19号染色体上[1-2]。研究[12]发现MEX3C 突变小鼠生长发育迟缓，且在C57BL/6小鼠背景下，85%的MEX3C突变小鼠在出生后不久死于呼吸不良。前期本课题组通过 X-gal 染色显示β-半乳糖苷酶活性，检测发现 MEX3C 在发育卵泡的颗粒细胞和卵母细胞中呈高度表达状态,但在卵泡膜细胞中没有表达或低表达。并且该基因参与早期胚胎发育和维持成人生殖系的全能性[13]，表明MEX3C 在发育的卵泡中发挥重要作用。本研究中我们应用MEX3C 基因敲除小鼠，通过观察不同基因型合笼窝产仔数和卵巢形态，探讨MEX3C基因缺失可否影响小鼠的繁殖。结果显示MEX3C+/-雄鼠与MEX3C+/-雌鼠交配每代窝产仔数均小于MEX3C+/-雄鼠与MEX3C+/+雌鼠交配的窝产仔数，提示MEX3C缺失可影响卵巢的贮备功能及卵泡的发育成熟。

卵巢的贮备功能是指卵巢产生卵子的数量和质量潜能，它与卵巢中原始卵泡池密切相关[14-15]。原始卵泡的启动、激活及闭锁是一个多因素调节过程，它的数量和维持时间直接决定可生育时间的长短。本研究结果显示，与MEX3C+/+组相比，MEX3C+/-组卵巢中原始卵泡数和初级卵泡数明显减少，闭锁卵泡数增加，次级卵泡的卵母细胞形态异常，且相同时间段内MEX3C+/-雄鼠与MEX3C+/-雌鼠交配子代数小于MEX3C+/-雄鼠与MEX3C+/+雌鼠交配子代数，提示在原始卵泡向成熟卵泡发育过程中，MEX3C可能对卵巢贮备、卵泡发育、卵母细胞的分化和成熟以及颗粒细胞功能产生重要的调控作用。

综上所述，MEX3C基因缺失可影响卵泡发育，减弱卵巢贮备功能，进而影响小鼠繁殖，其可能机制是MEX3C可激活原始卵泡，促进卵泡发育，减少卵泡闭锁。卵泡由原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡向成熟卵泡的发育过程中，不仅受促卵泡激素和雌激素的调节，且与各种细胞因子密切相关，如胰岛素生长因子(IGF-1)等。由于卵泡发育过程复杂且受多因素调节，所以该基因影响卵泡发育的具体机制目前尚不清楚。