多重聚合酶链反应在α-地中海贫血诊断中的应用价值

张应联，蔡小芳

厦门大学附属妇女儿童医院·厦门市妇幼保健院 (福建厦门 361001)

α-地中海贫血是一种以溶血性贫血为主要特征的单基因隐形遗传疾病，主要因α-珠蛋白基因的大片段缺失所致，在遗传学上具有较高的异质性，严重危害患者的生命健康。因此，临床上早期有效筛查α-地中海贫血，以进行早期对症处理意义重大[1]。目前，应用于α-地中海贫血检测的方法较多，包括血液检查、高效液相色谱法、毛细管电泳法及多重聚合酶链反应等，其中血常规检查虽能够进行筛查，但在红细胞基因具体分型中具有一定局限性；高效液相色谱法检测操作复杂、费用高，因此临床推广受到限制；而多重聚合酶链反应已经广泛应用于α-地中海贫血基因诊断中，且可对α-地中海贫血进行准确分型[2-3]。本研究旨在探讨多重聚合酶链反应在α-地中海贫血诊断中的应用价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年5月至2019年3月在我院出生的684例新生儿作为研究对象，所有新生儿均接受毛细管电泳法及多重聚合酶链反应检查。排除标准：孕母异常分娩及出现妊娠高血压；产前7 d内孕母血红蛋白水平<60 g/L；新生儿出现宫内缺氧及遗传性代谢性疾病；新生儿消化道出血；新生儿血型不合溶血。

1.2 方法

1.2.1毛细管电泳法检测

在新生儿顺利娩出，剪断脐带后，抽吸2 ml脐带血，抗凝后进行离心处理，3 000 r/min，离心3 min；取红细胞层样本18 μl置入90 μl溶血素稀释杯中，待测；采用法国Sebia公司生产的CapiLLarys2全自动毛细管电泳仪及相关配套试剂盒进行检测，检测过程中需严格遵照说明书操作，检测电压为9.8 kV，检测波长为145 nm，且需在碱性缓冲溶液前提下实施血红蛋白电泳，并详细记录该条件下各种血红蛋白百分比，且进行定量测定。

1.2.2多重聚合酶链反应

采用经典的酚-氯仿抽提法于待测静脉血中提取样品中的DNA；检测过程中使用的α-地中海贫血基因诊断试剂盒由深圳益生堂生物企业公司提供，需严格按照相关说明书操作，其中25 μl反应总体积中含有基因组DNA 0.1～1.0 μg，2.5 U Taq DNA酶；聚合酶链反应循环参数为95 ℃变性5 min，97 ℃变性45 s，61 ℃退火1 min 30 s，72 ℃延伸2 min 30 s，共35个循环；最后72 ℃延伸5 min；取每管中聚合酶链反应产物10 μl，并将2 μl电泳加样缓冲液加入管内，混合均匀，将混合产物加入1.0%琼脂糖凝胶加样孔中，保持温压进行约15 min的电泳后，置于UVP或VU灯下进行观察；聚合酶链反应产物在经过纯化后，采用MegaBACE1000型全自动毛细管测序仪测序。

1.3 临床评价

比较毛细管电泳法检测与多重聚合酶链反应检测的结果。电泳谱图根据不同血红蛋白分为15个区域，其中HbH=Z15，HbBart=Z12，HbF=Z7，HbA=Z9，HbA2=Z3，判定标准：正常，HbBart为0；静止型，HbBart为0.1%～1.5%；标准型，HbBart为1.6%～6.0%；中间型，HbBart为6.1%～40.0%；重型，HbBart为40.1%～90.0%。多重聚合酶链反应结果判定：根据深圳益生堂生物企业公司生产的α-地中海贫血基因诊断试剂盒进行分型诊断[4]。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 毛细管电泳法检测与多重聚合酶链反应检测结果

毛细管电泳法检测684例新生儿共筛选出α-地中海贫血阳性标本76例(11.11%)，多重聚合酶链反应检测684例新生儿共筛选出α-地中海贫血阳性标本101例(14.77%)，多重聚合酶链反应阳性检出率高于毛细血管电泳法，差异有统计学意义(χ2=4.056，P=0.044)，见表1。

表1 毛细管电泳法检测与多重聚合酶链反应检测结果[例(%)]

2.2 不同分型新生儿血液HbA及HbBart水平比较

不同基因分型α-地中海贫血患儿HbA及HbBart比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 不同分型新生儿血液HbA及HbBart水平比较

3 讨论

地中海贫血的发生可能为编码珠蛋白基因发生突变，使珠蛋白合成出现障碍，血红蛋白组分发生改变，常使患者出现不同程度的贫血症状，严重影响患者的身心健康。我国是α-地中海贫血高发国家，且目前临床针对该病尚无较为有效的治疗方案，因此，做好疾病的筛查工作，早期进行预防仍是临床研究的热点[5]，而选择适宜的检测方法以进行早期筛查尤为重要。

多重聚合酶链反应是在单一反应中同时加入数对引物以扩增出多个序列，且因多重聚合酶链反应的特异性，主要取决于模板与引物之间的相似性，随着引物对数的不断增加，导致得到错配引物的风险更大，因此在进行多重聚合酶链反应过程中，正确选择适宜的引物是检测的关键，且多重聚合酶链反应与经典的α-地中海贫血聚合酶链反应相比，其可减少检查重复次数，操作相对更加简单，可节省检测时间[6]。本研究结果显示，不同基因分型α-地中海贫血患儿HbA及HbBart存在一定差异性，且正常型基因型中HbA水平>静止型>标准型>中间型>重型，正常型HbBart水平<静止型<标准型<中间型<重型，因此临床中可根据贫血患者HbA及HbBart差异性进行分型评估。地中海贫血患儿HbA水平会随着病情严重程度增加而不断降低，且因患儿机体内β-珠蛋白可降低HbA水平，因此HbA水平与病情成负相关。静止型地中海贫血中存在1个α-基因的缺失，故另一个α-基因代偿功能会不断增强，但在新生儿出生后HbBart水平会迅速下降，但患者病情越严重，机体内的γ珠蛋白链合成量会不断增加，促进HbBart的形成，因此HbBart水平与α-地中海贫血病情严重程度成正相关。

综上所述，与毛细管电泳法相比，多重聚合酶链反应具有准确性高、快速等优点，可用于临床α-地中海贫血的筛查。