5种药物对异育银鲫“中科3号”受精卵孵化的影响

陈 斌，樊海平，薛凌展，管 碧，畅孟阳，钟全福，叶小军，张伟妮

( 1.福建省淡水水产研究所，福建 福州 350002； 2.福建农林大学 动物科学学院，福建 福州 350000 )

异育银鲫(Carassiusauratusgibelio)“中科3号”因其生长速度快、个体大、抗病力强受到广大养殖者喜爱[1-2]，成为我国鲫鱼(C.auratus)养殖的主要品种之一。水霉病是对淡水养殖鱼类危害较大的常见真菌性疾病之一，特别是在鱼类人工繁育过程中，鲤鱼(Cyprinuscarpio)、鲫鱼和黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)等黏性卵感染水霉的比例较高，孵化过程中的死卵及卵膜受损的受精卵最易受到水霉感染，这些卵感染后其内部滋生大量菌丝，蔓延，覆盖，传染侵入周围正常卵，导致胚胎死亡[3-7]。由于鲫鱼的繁殖季节为春季，繁殖水温为18～23 ℃，该水温范围正是霉菌极易暴发的环境条件，因此在异育银鲫“中科3号”苗种繁育过程中，如何有效减少霉菌感染比例及限制霉菌繁殖速度是提高孵化率的关键[8]。

生产上主要通过化学药物来抑制鱼卵和仔鱼的霉菌生长，常见的药物有高锰酸钾、过氧化氢、福尔马林、铬化合物(重铬酸钠、重铬酸钾、三氧化铬)、硫醚沙星(复合丙烯基二、三硫醚乳液)、氯化钠、溴硝丙二醇、碘伏(霉菌净)、五倍子(水霉净)等。由于这些药物缺乏高效性，同时存在较高的使用安全风险[9-13]，所以目前科研人员仍在不断探索开发新的抑杀霉菌药物，如筛选中草药抗水霉制剂[14-18]，研究异噻唑啉酮、磺基水杨酸、尼泊金乙酯、二硫氰基甲烷、丙酸钙、双乙酸钠、山梨酸钾等防霉剂对水霉的抑制效果[19-20]，开展新型杀菌剂立达霉[21]、复方甲霜灵粉(美婷)[22-23]等对鱼卵水霉病防治效果的研究与应用。虽然霉菌抑制剂的研发受到广泛的关注，但适合用于防治鱼卵水霉病的有效、安全药物仍较为匮乏。结合本单位中试基地近几年抗水霉药物的应用效果及文献资料中植物抑霉药物和食品抑霉剂的普遍好评率，本试验选择美婷Ⅱ、霉灵、高锰酸钾、杀毒矾和纳他霉素5种药物。其中美婷Ⅱ中的活性成分可以直接作用于菌体细胞膜表面的巯基醇，在细胞壁产生特大突起，使细胞壁破裂，菌体死亡，孢子失活；霉灵的主要成分可以渗透霉菌细胞壁，损伤细胞膜并改变其通透性，引起细胞亚微结构变性和细胞坏死，同时可以抑制霉菌芽孢转变为侵袭性的菌丝；高锰酸钾通过氧化菌体酶蛋白中的巯基使酶失活，导致菌体发生机能障碍而死亡，杀毒矾可以抑制霉菌RNA聚合酶的合成从而抑制RNA的生物合成，最终达到抑制霉菌的目的；纳他霉素可以与真菌的麦角甾醇及其他甾醇基团结合，阻碍麦角甾醇的生物合成，从而使细胞膜畸变，导致渗漏，引起霉菌细胞的死亡。笔者研究了5种药物对异育银鲫“中科3号”鱼卵水霉病的抑制效果和受精卵孵化的影响，以期寻找控制鱼卵水霉的有效安全药物，为异育银鲫“中科3号”的苗种繁育提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验用受精卵

以3龄雌性异育银鲫“中科3号”作为母本，3龄雄性福瑞鲤作为父本进行人工催产，催产水温控制在18～20 ℃，约16 h后开始人工挤卵、取精。采取干法人工授精，并将受精卵均匀铺在网片上用于试验。

1.2 试验药物来源

美婷Ⅱ由上海海洋大学研制，主要成分溴硝醇(皮乐宝)、硫酸亚铁，在有效性和安全性方面比美婷更具优势；霉灵由上海海洋大学研制，山西争跃化工药业有限公司生产，主要成分磺基水杨酸等；高锰酸钾(99%)，由衡阳市凯信化工试剂有限公司生产；杀毒矾(噁霜·锰锌)由先正达(苏州)作物保护有限公司生产，主要成分噁霜灵(8%)、代森锰锌(56%)；纳他霉素(99%)，由浙江多味化工食品有限公司生产。

1.3 试验方法

试验容器为5 L塑料桶，每桶装孵化用水3 L，放于孵化车间。将试验药物分别配置1000 mg/L母液，按照设计质量浓度分别添加到各试验桶中，混匀后剪取5 cm×10 cm的已铺卵的网片放于桶中进行静水孵化。每个质量浓度组和对照组均设置3个平行，日换水量为50%，并及时补充50%的试验药物，维持药物质量浓度。每24 h肉眼结合镜检观察受精卵1次，并将网片置于带水的玻璃平皿中，用手电从下方照射，计数发霉卵数量和未发霉卵数量。试验期间水温21～23 ℃，当鱼苗进入尾牙期时停止换水补药，孵化时间约76 h，待完全出膜后计数仔鱼数量。

参照各药物常用质量浓度，按等对数间距设置质量浓度梯度，试验药物质量浓度见表1。

1.4 数据统计分析

采用SPSS 17.0软件对样本数据进行单因素方差分析，数据结果表示为平均值±标准差，P<0.05为差异显著。

长霉率/%=n1/(n1+n2)×100%

孵化率/%=n3/(n1+n2)×100%

式中，n1为长霉卵数量，n2为未长霉卵数量，n3为孵出水花数量。

表1 试验药物质量浓度设置 mg/LTab.1 The concentrations of test drugs on mass basis

2 结 果

2.1 美婷Ⅱ对受精卵长霉率和孵化率的影响

试验结果显示，美婷Ⅱ可显著降低异育银鲫“中科3号”受精卵的长霉率，随着药浴质量浓度的升高，长霉率显著下降(P<0.05)；同一药浴质量浓度随浸泡时间的延长，受精卵的长霉率显著上升(P<0.05)(表2)。孵化效果试验显示，6.50 mg/L质量浓度组孵化率略高于4.90 mg/L组(P>0.05)，显著高于3.69 mg/L组、8.620 mg/L组和11.44 mg/L组及对照组(P<0.05)。

2.2 霉灵对受精卵长霉率和孵化率的影响

霉灵5个质量浓度组中，24 h内均可抑制霉菌生长，随着时间延长，各质量浓度组受精卵长霉率显著增加(P<0.05)；在48 h和72 h时，受精卵长霉率随着霉灵质量浓度的增加逐渐下降趋势明显，15 mg/L组的长霉率最低，仅为(1.05±0.1)%和(4.7±0.9)%，现在低于其他组(表3)。48 h时，7.62 mg/L组受精卵长霉率略低于3.87 mg/L组，但差异不显著(P>0.05)，其余各试验组间差异显著(P<0.05)；1.00 mg/L组进入72 h时霉菌感染率明显上升，长霉率达到(40.3±0.6)%与对照组差异不显著(P>0.05)，1.97、3.87、7.62 mg/L 3个试验组受精卵长霉率分别增加了3.8%、7.7%、7.5%，3组间差异不显著(P>0.05)。

综合分析，当霉灵质量浓度为1.97 mg/L时，受精卵孵化率最高，长霉率控制在(23.9±2.8)%，当霉灵质量浓度升至15.00 mg/L时，霉菌生长受到限制，长霉率仅为(4.7±0.9)%，但该质量浓度显著影响受精卵孵化，其孵化率仅为(31.1±1.4)%，显著低于其他组。

2.3 高锰酸钾对受精卵长霉率和孵化率的影响

5个质量浓度的高锰酸钾在24 h内能均能抑制水霉生长，随浸泡时间的延长，高锰酸钾抑菌效果逐渐下降，同一质量浓度组72 h受精卵长霉率显著高于48 h(P<0.05)；而24 h以后，随着试验质量浓度的增加，受精卵长霉率逐渐下降，48 h时6.25 mg/L组的长霉率最低，仅为(6.0±0.9)%，显著低于其他组(P<0.05)；72 h时各组的长霉率均有所增加，但仍低于对照组(P<0.05)，其中6.25 mg/L组的长霉率相对于48 h上升显著(P<0.05)，达(29.0±1.4)%。孵化效果试验显示，各试验组的孵化率均高于对照组，其中2.50 mg/L组的孵化率最高，达到(54.0±4.0)%，显著高于其他组(P<0.05)(表4)。

表2 美婷Ⅱ对受精卵长霉率和孵化率试验结果Tab.2 The incidence of mildew and hatching rate of fertilized eggs exposed to Mei Ting Ⅱ

注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)；同行数据肩标不同大写字母表示差异显著(P<0.05)，相同大写字母表示差异不显著(P>0.05)；下同.

Note: means with different letters in the same column are significant difference (P<0.05), means with the same letters are not significant difference (P>0.05); means with different capital letters in the same line are significant difference (P<0.05), with the same capital letter are not significant difference (P>0.05)； et sequentia.

表3 霉灵对受精卵长霉率和孵化率试验结果Tab.3 The incidence of mildew rate and hatching rate of fertilized eggs exposed to Mei Ling

表4 高锰酸钾对受精卵长霉率和孵化率试验结果Tab.4 The incidence of mildew rate and hatching rate of fertilized eggs exposed to potassium permanganate

2.4 纳他霉素对受精卵长霉率和孵化率影响

当纳他霉素的质量浓度为1.5～5.00 mg/L时，24 h内霉菌抑制效果显著，霉菌感率为0。1.00 mg/L组也能有效抑制水霉生长，长霉率显著低于对照组(P<0.05)；48 h和72 h，高于1.50 mg/L的各质量浓度组能有效抑制水霉生长，长霉率显著低于1.00 mg/L组和对照组(P<0.05)，但72 h受精卵长霉率与48 h差异不显著(P>0.05)，而1.00 mg/L组和对照组72 h受精卵长霉率显著高于48 h(P<0.05)，且1.00 mg/L组48 h和72 h的受精卵长霉率与对照组无显著差异(P>0.05)(表5)。

孵化率以1.50 mg/L组最高，显著高于其他试验质量浓度组和对照组(P<0.05)，其次为2.24 mg/L组，显著高于1.00、3.34、5.00 mg/L组和对照组(P<0.05)，而1.00、3.34、5.00 mg/L组和对照组之间差异不显著(P>0.05)。

2.5 杀毒矾对受精卵长霉率和孵化率影响

孵化24 h时，0.33 mg/L组和0.50 mg/L组的水霉抑制效果显著，受精卵均未感染霉菌。48 h时，各组的霉菌感染率均出现了显著增加，0.33 mg/L组和0.50 mg/L组受精卵长霉率虽显著低于其他质量浓度组和对照组(P<0.05)，但是其长霉率也分别达到了(15.5±1.7)%和(14.6±0.8)%，差异不显著(P>0.05)；72 h后，各组受精卵的霉菌感染率进一步提高，其中0.10 mg/L组的长霉率高达(50.0±0.7)%，显著高于其他各组(P<0.05)，0.50 mg/L的长霉率最低，仅为(23.4±1.0)%，显著低于其他组(P<0.05)。孵化效果试验显示，各试验质量浓度组的受精卵孵化率均显著低于对照组(P<0.05)，其中以0.15 mg/L组孵化率较高，孵化率为(36.1±2.2)%，略低于对照组(P<0.05)，0.50 mg/L组孵化率最低，仅为(9.8±1.0)%，显著低于对照组(P<0.05)(表6)。

表5 纳他霉素对受精卵长霉率和孵化率试验结果Tab.5 The incidence of mildew and hatching rate of fertilized eggs exposed toy Natamycin

表6 杀毒矾对受精卵长霉率和孵化率试验结果Tab.6 The incidence of mildew and hatching rate of fertilized eggs exposed to oxadixyl mancozeb

3 讨 论

3.1 不同药物对受精卵水霉控制作用

水霉病是鱼卵孵化过程中的一种常见病，常给苗种生产造成较大损失。多年来国内外不断进行抗水霉有效药物的筛选和开发，主要以消毒剂、防霉防腐剂和中草药制剂为主。虽然这些药物对水霉均有一定的抑制作用[19-27]，但有些药物的有效抑制质量浓度远超过安全质量浓度，不适合应用于生产；有些药物如美婷、过氧化氢等疗效较好，但因使用成本较高而无法推广应用[13-28]。本试验选择了常用消毒剂高锰酸钾，农用杀菌剂杀毒矾，食品防腐剂纳他霉素，渔药美婷Ⅱ和霉灵等5种药物用于异育银鲫“中科3号”受精卵孵化期间水霉的抑制试验及其对孵化率的影响研究。其中杀毒矾是农药类新型混合杀菌剂，对一些植物真菌性病害有较高的防治效果[29]。纳他霉素是一种多烯类抗真菌的生物防腐剂，能够抑制丝状真菌的生长，广泛用于食品防腐和医学上的应用[30-31]。高猛酸钾作为最强的氧化剂之一，常被应用于医疗、化工、动物养殖、苗木培育等各个领域，可以防治水生动物的水霉病和腐皮病[32-33]，还对葡萄的霉斑病有一定的治疗效果[34]。

试验结果显示，5种药物对异育银鲫“中科3号”受精卵的水霉均一定的抑制作用，其抑霉率为美婷Ⅱ>霉灵>高锰酸钾、纳他霉素和杀毒矾。美婷Ⅱ和霉灵均为上海海洋大学研制，美婷Ⅱ主要成份溴硝醇(皮乐宝)，为新型化妆品防腐剂。有学者探讨了溴硝醇对虹鳟(Oncorhynchusmykiss)、比目鱼(Hippolossushippolpssus)、大西洋鳕(Gadusmoehua)、黑线鳕(Melanogrammusaeglefinus)等鱼卵水霉的抑制效果，均证实采用短时间浸浴的方法能够有效抑制水霉滋生，提高受精卵的孵化率[35-38]，其抑制霉菌的效果在本试验中进一步证实，其优点是抑制霉菌效果好，孵化率高，其缺点是使用质量浓度高，成本高。霉灵主要成分为磺基水杨酸，具有防霉杀菌作用，磺基水杨酸对水霉具有较好的体外抗菌效果[19]，其抑制霉菌的效果也同样在本试验中得以体现，但是相对于美婷Ⅱ，霉灵的抑菌效果更差一些，其优点是使用质量浓度低且药物价格低，能够节约生产成本。

3.2 药物质量浓度及作用时间对受精卵长霉率影响

药物的使用质量浓度和作用时间对鱼卵水霉的防治效果存在明显的差异。随着药物浸泡质量浓度的增加，受精卵长霉率逐渐降低；随着浸浴时间的延长，受精卵长霉率逐渐升高。霉灵、高锰酸钾、纳他霉素和杀毒矾低质量浓度组对鱼卵寄生水霉没有抑制效果，而杀毒矾低质量浓度组72 h的受精卵长霉率反而显著高于对照组，可能与杀毒矾对异育银鲫“中科3号”受精卵毒性较大，造成鱼卵死亡数量较多，而受伤或死亡的鱼卵更易滋生霉菌[3]，导致受精卵长霉率进一步升高；而纳他霉素2.24 mg/L以上质量浓度组72 h的受精卵长霉率则略低于48 h，说明该药物在水中结构稳定、药效长。亦有研究结果表明，纳他霉素是一种高效、专一的抗真菌抑制剂，具有较好的稳定性，可专一性地与霉菌细胞膜中的麦角固醇结合，提高对霉菌的持续抑制作用[39-40]，与该试验结果完全相符。因此纳他霉素在水霉抑制方面具有一定开发应用前景。

3.3 药物对受精卵孵化率的影响

水霉寄生是严重影响淡水鱼受精卵孵化的一个主要因素，尤其是在水温较低的早春季节，为提高淡水鱼受精卵孵化率，生产上通常采用一些药物来防治受精卵的水霉病，并以受精卵孵化率或出苗率来评估药物的实际防治效果。除了杀毒矾外，一定质量浓度的美婷Ⅱ、霉灵、高锰酸钾、纳他霉素均能显著提高异育银鲫“中科3号”受精卵孵化率，说明美婷Ⅱ、霉灵、高锰酸钾、纳他霉素对异育银鲫“中科3号”受精卵的毒副作用较小，而杀毒矾各试验质量浓度组受精卵的孵化率均低于对照组，说明杀毒矾对异育银鲫“中科3号”受精卵的毒副作用较大，不适合应用于受精卵孵化。

同一药物不同质量浓度对受精卵孵化率差异极大，5种试验药物的受精卵孵化率均为中质量浓度组>低质量浓度组>高质量浓度组，说明试验药物高于适宜质量浓度均对受精卵产生毒性作用，影响孵化率；同样，低质量浓度药物未能有效控制鱼卵水霉繁殖，导致受精卵孵化率下降。因此，各种防霉药物在应用到孵化生产之前，一定要根据试验结果得出最适使用量，才能同时发挥药物安全和高效的特性。

试验结果显示，美婷Ⅱ对异育银鲫“中科3号”受精卵适宜使用质量浓度为4.90～6.50 mg/L，适合长时间浸浴，对水霉的抑制效果良好且孵化率较高，这与夏文伟等[23-24]的研究结果基本一致，而孙鹏等[35]建议使用高质量浓度溴硝醇浸泡15 min短时间使用；霉灵对异育银鲫“中科3号”受精卵的适宜使用质量浓度为1.97～3.87 mg/L，与该渔药的建议使用剂量说明基本一致；高锰酸钾对异育银鲫“中科3号”24 h内浸泡效果显著，受精卵的适宜使用质量浓度为2.50 mg/L，远低于张繁荣等[32]用15.0 mg/L的高锰酸钾溶液每隔3 d浸洗1次，每次浸洗时间10 min的使用方法；纳他霉素对异育银鲫“中科3号”受精卵的适宜使用质量浓度为1.50 mg/L，孵化率与美婷Ⅱ和霉灵无显著差异(P>0.05)，具有高效、无毒和低残留特性[39]，具有良好的开发应用前景；而杀毒巩对水霉的抑制效果不甚理想，较强的毒副作用严重影响了“中科三号”受精卵的孵化率，不适合应用于鱼卵的孵化生产。