慢性心衰患者稳定期Bax、Bcl-2水平及其与心功能的关系

刘文秀，苏 畅，白素芬，齐书英，汝磊生

联勤保障部队第九八〇医院1心内科，2心胸外科，河北 石家庄 050082；3华北理工大学中医学院中西医临床系，河北 唐山 063210

心衰是一组复杂的临床综合征，是全球病死率最高、住院率最高的疾病[1]。慢性心衰（CHF）的机制复杂，且不十分明确。心肌细胞凋亡是主要机制之一，人和动物模型都提示凋亡与心衰有关，且凋亡参与从心肌肥大到心衰的发展[2]。B淋巴瘤-2（Bcl-2）家族是一个参与凋亡和抗凋亡的大家族，Bcl-2是一种抗凋亡蛋白，而Bcl-2相关X蛋白（Bax）是促细胞死亡的蛋白，是细胞死亡的负调节因子。多项动物实验和临床研究证实，Bcl-2和Bax参与慢性心衰的发展。目前关于Bcl-2和Bax在心肌细胞凋亡方面的研究较少，未见到有关慢性心衰稳定期患者循环炎症细胞中Bcl-2和Bax水平的研究，且Bcl-2和Bax水平与心功能的关系未知。本研究对CHF稳定期患者循环炎症细胞中Bcl-2和Bax水平进行报道，并分析Bcl-2和Bax水平与心功能的关系，帮助认识心衰的发病机制，对心衰的基因治疗提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究纳入60例2014年3月～2016年12月在我院心内科住院的稳定期CHF患者，包括32例男性和28例女性，年龄53～72岁（63.4±6.2岁）。60例患者中，28例为冠心病（CHD）心衰（有心肌梗死和/或冠状动脉狭窄病史），15例为高血压性心脏病（HHD）心衰（有明确的高血压病史，排除冠状动脉狭窄、瓣膜病等），17例为心肌病（CM，多为原发性心肌病）心衰（无明确的高血压病、冠心病、瓣膜病、先天性心脏病等）。CHF组给予常规心衰治疗。对照组纳入30例健康人，均为来院门诊健康体检者，无心脏疾病，包括16例男性和14例女性，年龄49～70岁（60.7±6.1岁）。

1.2 选择标准

1.2.1 纳入标准 病例组由心脏病专家根据病史、体格检查、心脏超声、胸片、冠脉造影等检查确诊，心脏彩色多普勒超声LVEF均＜45%（根据2007中国慢性心力衰竭诊断治疗指南），为美国心脏病学会/协会心功能C期，或纽约心脏病协会心功能Ⅰ～Ⅳ级，经治疗后心功能稳定至少1月入组。

1.2.2 排除标准 严重的肝肾功能异常；感染；恶性肿瘤患者；电解质紊乱；精神疾病；使用抗生素者；使用肝素者；急性心肌梗死；怀孕或哺乳期。本研究经医院伦理学委员会批准同意执行。

1.3 定量反转录定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测Bcl-2和Bax mRNA的表达

晨起快速收集所有病例的静脉血，用Ficoll-Paque PLUS淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞（PBMC）。PBMC在加入10% FBS的RPMI-1640细胞培养基中培养2 h（37 ℃，5% CO2）。移除细胞悬液，PBMC即附着于培养基壁上生长，直至长满。每24 h更换培养液。

以TRIzol试剂消化并收集，供提取所有RNA；再通过反转录合成cDNA，用来做qRT-PCR的模板，条件如下：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s 90次，54 ℃ 30 s，72 ℃1 min。GAPDH用来做内参。

1.4 测量左室射血分数（LVEF）

LVEF由经胸彩色多普勒超声HP SONOS5500系统（飞利浦，荷兰阿姆斯特丹）测定。

1.5 统计学方法

所有数据以SPSS 21.0和Graphpad Prism 5 for Windows软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，正态性检验采用D’Agostino & Pearson omnibus检验，方差齐性检验采用Levene法检验；两组间比较采用均数间比较t检验；多组间均数比较采用单因素方差分析；多组间均数两两比较采用Student-Newman-Keuls检验；不符合正态分布或方差不齐时，两组间比较采用Wilcoxon秩和检验；多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验；计数资料以百分数和例数表示，计数资料多个样本率的比较采用χ2检验；相关性分析采用Pearson相关检验；方差不齐或等级资料相关性分析采用Spearman秩相关检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料结果

根据病因将CHF组分为3个亚组：CHD组、HHD组和CM组。CHD组年龄高于HHD组和CM组（P＜0.05）。CHD组吸烟比例高于HHD和CM组（P＜0.01）。HHD组高血压病比例高于CHD组，CHD组高于CM组（P＜0.01）。CHD组糖尿病比例高于HHD组（P＜0.05），HHD组高于CM组（P＜0.01）。CHD组使用阿司匹林比例高于HHD和CM组（P＜0.01）。CHD组使用他汀类药物比例高于HHD组（P＜0.01），HHD组高于CM组（P＜0.01）。CHF组LVEF低于对照组（P＜0.01）。CHF组N-末端B型钠尿肽前体（NT-proBNP）、左室舒张末期内径（LVEDD）、左房内径、右室舒张期横径值高于对照组（P＜0.01，表1）。

2.2 CHF组和对照组Bcl-2和Bax mRNA水平的比较

CHF组外周血单核细胞Bcl-2 mRNA水平低于对照组（P＜0.01，图1A）；Bax mRNA水平高于对照组（P＜0.01，图1B）。

2.3 CHF 3个亚组Bcl-2和Bax mRNA水平的比较

3个亚组分别与对照组相比，外周血单核细胞Bcl-2和Bax mRNA水平的差异均有统计学意义（P＜0.01，图2A）。组内两两比较，Bcl-2和Bax mRNA水平差异无统计学意义（P＞0.05，图2B）。

2.4 Bcl-2、Bax mRNA水平与NHYA心功能分级的相关性

CHF组外周血单核细胞Bcl-2 mRNA的水平与NYHA心功能分级呈负相关（rs=-0.494,P=0.039，图3），Bax mRNA的水平与NYHA心功能分级呈正相关（rs=0.536,P=0.041）。

2.5 Bcl-2、Bax mRNA水平与LVEF的相关性

CHF组外周血单核细胞Bcl-2 mRNA水平与LVEF呈正相关（r=0.497,P=0.035，图4），Bax mRNA水平与LVEF呈负相关（r=-0.446,P=0.043）。

2.6 Bcl-2、Bax mRNA水平与NT-proBNP浓度的相关性

CHF组外周血单核细胞Bax mRNA水平与NT-proBNP浓度呈正相关（r=0.374,P=0.003，图5）。Bcl-2 mRNA水平与NT-proBNP浓度无相关性（r=-0.227,P=0.082）。

表1 研究对象一般临床资料

图1 CHF组和对照组Bcl-2和Bax mRNA水平的比较

图2 CHF 3个亚组Bcl-2和Bax mRNA水平的比较

图3 Bcl-2、Bax mRNA水平与NHYA心功能分级的相关性

图4 Bcl-2、Bax mRNA水平与LVEF的相关性

2.7 Bcl-2、Bax mRNA水平与LVEDD的相关性

CHF组外周血单核细胞Bax mRNA水平与LVEDD呈正相关（r=0.289,P=0.025，图6），Bcl-2 mRNA水平与LVEDD无相关性（r=-0.168,P=0.201）。

图5 Bcl-2、Bax mRNA水平与NT-proBNP浓度的相关性

图6 Bcl-2、Bax mRNA水平与LVEDD的相关性

3 讨论

凋亡导致逐渐丢失的心肌细胞加速了疾病的进程[3]。在射血分数降低的心衰中，心肌细胞凋亡在左室功能障碍的发展中起重要作用，且射血分数降低的心衰心肌细胞丢失是一个明确的特点[4-5]。细胞的命运大部分程度由促和抗凋亡因素表达的相对水平决定。Bcl-2家族中的Bcl-2是最主要的一种抗凋亡蛋白，而Bax是促细胞死亡的蛋白，是细胞死亡的负调节因子[6]，Bcl-2通过阻止Bax释放细胞色素C对其抑制作用[7]。Bax阻止细胞凋亡主要依赖于Bcl-2和Bax的比值。当Bcl-2过剩时，Bax/Bcl-2二聚体形成，细胞受保护。然而，当Bax占多数时，Bax二聚体形成，细胞将启动程序性细胞死亡。Bax还可能参与通道形成，减缓心衰进程[8]。

小鼠动物模型试验表明，慢性缺氧、牵拉和长期压力过重引起的心衰鼠心脏细胞凋亡明显增加，Bax水平明显升高，Bcl-2水平明显降低。在试验中，Bax基因的表达可以增加心脏压力负荷过重时Bcl-2的表达[9]。升高的Bax可能通过加速电压依赖性离子通道来调节细胞色素C从线粒体释放[10]。国内的研究表明，与对照组相比，心衰模型小鼠心肌细胞凋亡明显增加，Bax凋亡指数明显升高，Bcl-2凋亡指数明显降低，心肌细胞Bax/Bcl-2比值显著升高[11]。在Bcl-2基因转导的心衰小鼠模型中，6周后可见心肌细胞凋亡减少，心室重构改善[12]。但目前对于Bcl-2和Bax在CHF稳定期患者中mRNA水平的临床研究很少，且有不一致的结论。研究报道缺血性心肌病和扩张型心肌病终末期心衰患者心肌组织Bax和Bcl-2表达均增加，缺血性心肌病组更明显[13]。且Bax/Bcl-2参与心衰的机制仍不明确。动物实验表明，Bax缺失不能使Ku70基因敲除的小鼠的心功能恢复正常，提示Ku70蛋白作为双链DNA修复、复制、转录调控的关键核蛋白，Bax可能通过与Ku70基因的相互作用来导致心功能恶化[14]。另有动物实验证实，Bax表达的增加和其与VDAC（电压依赖性阴离子通道）的相互作用可导致线粒体的tRNA突变，加重心脏损害[15]。临床研究表明，Bax基因的过甲基化可能参与增加70岁以上人群冠心病的风险[16]。

PBMC为多能髓系祖细胞，在特定条件下可分化为血细胞、心肌源性细胞和内皮细胞[17]。体外实验也证实，移植到心梗小鼠和兔模型上时，人PBMC可分化为心肌细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞，参与缺血心脏再生[18]。最新的研究表明，高分化人心肌细胞可由PBMC起源的多能干细胞分化而来[19]。人的心肌细胞获取困难，对PBMC凋亡相关基因的研究，可从一定程度上反映心肌细胞凋亡相关基因的功能。

本研究显示，CHF组外周血单核细胞Bcl-2 mRNA水平低于对照组；Bax mRNA水平高于对照组。与心衰动物试验中Bcl-2表达降低，Bax表达增加的趋势一致；与Bcl-2凋亡指数降低，Bax凋亡指数升高的趋势亦一致，表明CHF稳定期患者外周血单核细胞的Bcl-2和Bax mRNA水平与心肌细胞Bcl-2和Bax表达水平同步。CHF时Bcl-2和Bax表达的改变，增加了心肌细胞对凋亡的易感性，加重心衰的进展，进一步证明在CHF的发展过程中，心肌细胞凋亡起到了一定作用，发生凋亡的机制与Bcl-2和Bax水平的改变有关。Bcl-2和Bax mRNA表达水平3个亚组中的两两比较，无统计学差异。CHF组外周血单核细胞Bcl-2 mRNA水平与NYHA心功能分级呈负相关，与LVEF呈正相关；Bax mRNA水平与NYHA心功能分级呈正相关，与LVEF呈负相关。Bax mRNA水平还与NT-proBNP浓度和LVEDD呈正相关。Bcl-2 mRNA水平与NT-proBNP浓度和LVEDD的相关性未达到统计学意义，但有正相关的趋势，可能与样本量较小有关。

总之，Bcl-2和Bax这一对凋亡相关基因在慢性心衰稳定期表达发生明显变化，各种病因所致的CHF可能导致这一对凋亡相关基因共同的改变，且mRNA水平与CHF病情严重程度相关，可能成为CHF预后因子之一。本研究未统计合并房颤的心衰患者，但已有研究表明，Bcl-2/Bax表达失衡可能参与房颤的发生发展[20]。可在后续的工作中对其进一步研究。