海洋土曲霉C23-3 与不同类型海洋微生物共培养对其次生代谢产物的影响

梁金月，李文卿，杨静明，刘亚月，聂影影，杨文聪，张 翼,2

（1.广东海洋大学食品科技学院// 广东省水产品加工与安全重点实验室// 广东省海洋生物制品工程实验室// 广东省海洋食品工程技术研究中心//水产品深加工广东普通高等学校重点实验室// 湛江市脑健康海洋药物与营养品重点实验室// 广东海洋大学海洋药物研究所，广东 湛江 524088；2. 广东海洋大学深圳研究院，广东 深圳 518120）

辽阔深邃的海洋占地球表面积约70%，其中蕴藏着高度的生物多样性和丰富的天然产物资源[1]，海洋真菌等海洋微生物为适应海洋高盐、高压、低温、寡营养等有别于陆地的多样化生境和激烈的生存竞争，进化出可产生多样化生物活性次生代谢产物的潜力，如较早发现的头孢霉素C已衍生出庞大的头孢霉素家族，环孢霉素A则被用于免疫抑制剂，越来越多的抗肿瘤活性物质也在海洋真菌中被发现，海洋真菌正日益受到科研人员的重视[2]。然而脱离了自然生境的海洋真菌等微生物，在实验室人工培养条件下大部分次级代谢产物途径并不能充分表达，有研究表明通过接触性或非接触性的共培养方法，能够利用微生物种群之间的协同代谢或诱导作用，有效激活这些沉默表达途径，从而提高微生物次生代谢产物的产量以及多样性[3]。如OH等[4]将一株海洋真菌Libertella（CNL-523）与一株海洋细菌aproteobacterium（CNJ-328）共培养，从共培养提取物中分离纯化得到4个新化合物，分别为libertellenones A-D；OH 等[5]将一株海洋真菌Emericellasp.和一株海洋放线菌Salinispora arenicola共培养，从共培养提取物中得到2个新化合物emericellamides A和B。董杰杰等[6]将海洋真菌Aspergillussp.SCSGAF 0076与细菌Bacillussp.MNMCCE 001共培养，发现共培养提取物中的抗菌活性化合物青霉酸以及红色素含量均比Aspergillussp.SCSGAF 0076纯培养时高。这些表明共培养是一种激活沉默次生代谢途径的有效手段。

土曲霉(Aspergillus terreus)属于子囊菌门(Ascomycota) 散囊菌纲(Eurotiomycetes) 散囊菌目(Eurotiales)发菌科(Trichocomaceae)曲霉属(Aspergillus)，是广泛存在于海洋和陆地的一种真菌[7]。丁内酯和土震素类化合物是土曲霉次级代谢产物中的代表性化合物，研究发现丁内酯类化合物具有良好抗炎[8-9]、神经元保护[10]、抗氧化[11]以及抗菌[12]等作用，土震素类化合物具有强的乙酰胆碱酯酶抑制活性[13]，考虑到乙酰胆碱酯酶抑制剂仍是迄今临床阿尔兹海默症药物的主流，而大脑氧化应激在阿尔兹海默症发展过程中发挥了广泛作用[14-15]，故土曲霉次生代谢产物的研究对于寻找抗阿尔兹海默病的先导化合物具有一定研究价值。

本实验室在前期研究中发现一株南海珊瑚来源的海洋真菌土曲霉C23-3 的代谢产物具有一定的抗菌、抗氧化及乙酰胆碱酯酶抑制活性，并发现其可产生特征性次生代谢产物丁内酯-I[7,15]。本研究选用该菌株分别与海洋真菌胶红酵母、海洋细菌枯草芽孢杆菌（革兰阳性，G+）和副溶血弧菌（革兰阴性菌，G-）等3 种类型微生物进行共培养，研究共培养对次生代谢的影响，以期诱导土曲霉C23-3产生更高产或更丰富的丁内酯类等活性次生代谢产物，为寻找具有抗阿尔兹海默病等活性的先导化合物提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器与试剂 多功能紫外透射仪WFH-201B（上海精科实业有限公司）、电热恒温培养箱HPX-9082MBE（上海博讯实业有限公司）、高效液相色谱仪1260 Infinity Ⅱ（美国安捷伦科技有限公司）、分析天平ME204E（德国梅特勒托利多公司）、酶标仪Epoch2（美国伯腾仪器有限公司）、超声波清洗机300ZED（昆山禾创超声仪器有限公司）、旋转蒸发仪R-300（瑞士步琦公司）、全自动高压灭菌锅IRM-100（德国爱安姆公司）、生物安全柜BSC-1300 II A2（上海博讯实业有限公司）。

碘化硫代乙酰胆碱(Acetylthiocholine，ATCI)，sigma，DA0048；5，5-二硫代二硝基苯甲酸(Dithiobisnitrobenzoicacid，DTNB)，Ruibio，D8130；乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)，Sigma，C3389；牛血清白蛋白(BSA)，Sigma，A1933；二苯代苦味酰自由基(1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl,DPPH)，Sigma，D9132；GF254 硅胶高效薄层层析板购自德国默克公司；海盐（湛江海之仪有限公司），酮康唑（≥98%）和氨苄青霉素钠（≥98%）购自上海阿拉丁试剂公司；二甲基亚砜、甲醇、超纯水、三氯化铁、铁氰化钾均为国产分析纯试剂，高效液相色谱分析用甲醇为色谱甲醇。

1.1.2 生物材料 海洋真菌土曲霉Aspergillus terreusC23-3（GDMCC No.60316）采自湛江徐闻珊瑚保护区，现保存于广东省微生物菌种保藏中心；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilisMCCC 1A03710）购自中国海洋微生物菌种保藏中心；副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）由广东海洋大学水产学院温崇庆教授赠予；胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）由广东海洋大学徐春厚教授赠予。

1.1.3 培养基配制 大米固体培养基：糙米50 g、质量浓度2%半人工海水60 mL；海水马铃薯蔗糖固体培养基：500 mL 的马铃薯汁、蔗糖20 g、蛋白胨5 g、海盐20 g、加入蒸馏水定容至1 L，pH＝7.2± 0.2；沙氏培养基：蛋白胨10 g、葡萄糖40 g、琼脂20 g、纯水定容至1 L，pH＝5.6 ± 0.2；MH 肉汤培养基：牛肉膏5 g、可溶性淀粉1.5 g、酪蛋白水解物17.5 g、琼脂20 g、纯水定容至1 L，pH＝7.2～7.4；海生菌琼脂培养基2216E：酵母膏1 g、蛋白胨5 g、琼脂16 g、粗海盐20 g、纯水定容至1 L。酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基YPD：酵母膏10 g、葡萄糖20 g、蛋白胨20 g、琼脂20 g、粗海盐20 g、纯水定容至1 L。

1.2 方法

1.2.1 菌株次生代谢产物的TLC 分析 参照文献[16]，以氯仿：甲醇(V/V=7∶1)为TLC 展开剂，记录254 nm 和365 nm 紫外图像，DPPH 自由基清除活性自显影图像（若物质具有活性，则呈明显斑点，非活性部分显紫色），乙酰胆碱酯酶抑制活性自显影图像（白色为活性部分，其余部分为黄色），茴香醛硫酸显色及铁氰化钾-三氯化铁显色图像。

1.2.2 菌株纯培养与提取 将已经活化的枯草芽孢杆菌、副溶血性弧菌、胶红酵母和土曲霉C23-3切块分别置于装有大米固体培养基的500 mL 锥形瓶中培养，12 d 时，取1/4 的大米培养基，用150 mL甲醇超声提取、过滤、浓缩得粗提物；余下的3/4继续培养至24 d 时用450 mL 甲醇超声提取、过滤、浓缩得粗提物，均设置2 个平行试验。

1.2.3 活菌株与土曲霉C23-3 共培养与提取 在超净台中，用移液枪各取10 mL 枯草芽孢杆菌、副溶血弧菌和胶红酵母的菌液分别接种于已灭菌的大米培养基中，28 ℃培养4 d 后再分别放入土曲霉C23-3菌块进行共培养；12 d 时，取1/4 的大米培养基，用150 mL 甲醇超声提取、过滤、浓缩得粗提物；余下的3/4 继续培养至24 d 时用450 mL 甲醇超声提取、过滤、浓缩得粗提物，试验均设置2 个平行。

1.2.4 灭活菌体与土曲霉C23-3 共培养与提取 在超净台中，用移液枪各取10 mL 枯草芽孢杆菌、副溶血弧菌和胶红酵母的菌液分别接种于已灭菌的大米培养基中，在28 ℃培养4 d 后于121℃灭菌21 min 得到已灭活的各菌株菌体，最后再分别放入土曲霉C23-3 菌块进行共培养；12 d 时，取1/4 的大米培养基，用150 mL 甲醇超声提取、过滤、浓缩得粗提物；余下的3/4 继续培养至24 d 时用450 mL 甲醇超声提取、过滤、浓缩得粗提物，试验均设置2 个平行。

1.2.5 HPLC 分析 将培养时间相同的不同培养条件下得到的各提取物用适量同样体积的甲醇溶解，过0.22 μm 的微孔滤膜，供检测用。

Agilent C18色谱柱(4.6 mm × 150 mm，4 μm)，流速为1.0 mL·min-1，柱温为30℃，进样量为10 μL，检测波长254 nm；流动相梯度条件为0～ 30 min:由体积分数10%甲醇～ 90%水梯度洗至100%甲醇；30～ 40 min:甲醇/水＝100%～ 100%；40～ 45 min:甲醇/水＝100%～10%；45～ 50 min:甲醇/水＝10%～10%。

1.2.6 抗菌试验 采用滤纸片法进行抗菌试验，将培养基倒至平板中，待培养基凝固后，吸取100 μL 0.5 麦氏浊度的菌液，用涂布棒均匀涂布在固体平板上，将负载有待测样品的6 mm 滤纸片(每个滤纸片负载200 μg 待测样品）用镊子紧贴在平板表面，氨苄青霉素钠和酮康唑用于阳性对照(每个滤纸片负载10 μg 氨苄青霉素钠或酮康唑），然后把平板倒置于4℃约10 h，后将真菌平板置于28℃培养箱、细菌平板置于37℃培养箱中培养13 h，记录抑菌圈直径大小，每个实验做2 个平行。

2 结果与分析

2.1 菌株培养的表观形态对比 如图1 所示，菌株土曲霉C23-3 在生长前期呈白色，随着培养时间的增加颜色由白色变为深棕色（J1-J3）。枯草芽孢杆菌随着培养时间的增加菌株由原来的浅黄色变为棕黄色，菌体生长也越来越旺盛（A1-A3），枯草芽孢杆菌与土曲霉C23-3 共培养（C1-C3），枯草芽孢杆菌呈深棕色，土曲霉C23-3 呈白色；副溶血弧菌随着培养时间增加颜色由浅黄色变为深黄色（D1-D3），当副溶血弧菌与土曲霉C23-3 共培养至12 d 白色的土曲霉几乎把整个大米培养基覆盖（F1-F3）。胶红酵母随着培养时间的增加由浅红色变为深红色（G1-G3），当胶红酵母与土曲霉C23-3共培养时（I1-I3），可观察到这2 种真菌都有生长。

图1 菌株在不同培养时期的生长形态Fig.1 Growing morphology of strains during different cultured periods

2.2 粗提物TLC 自显影活性成分分析 将发酵粗提物用同样体积甲醇溶解，以玻璃毛细管定量点样到GF254 硅胶高效薄层层析板上，进行TLC 紫外及显色分析，对比不同培养条件下代谢产物的TLC指纹图谱（图2）可知土曲霉在不同共培养条件下均能产生丁内酯-I，由图2-A4可知，不同灭活菌体与土曲霉C23-3 共培养提取物中丁内酯-I 斑点比对应活菌与土曲霉C23-3 共培养提取物中丁内酯-I 斑点明显大，这表明在培养12 d 时灭活菌体与土曲霉C23-3 共培养所产生的丁内酯-I 含量比活菌与土曲霉C23-3 共培养产生的丁内酯-I 多。由图2 中的B4、D4和E4可知，副溶血弧菌灭活菌体与土曲霉C23-3共培养提取物中的大极性（Rf＜0.4）荧光斑点物质、大极性（Rf＜0.3）抗氧化成分和酚胺类物质明显比土曲霉C23-3 纯培养提取物更加丰富多样；由图2中的B5、D5和E5可知，副溶血弧菌与土曲霉C23-3共培养提取物和副溶血弧菌灭活菌体与土曲霉C23-3 共培养提取物中的大极性（Rf＜0.4）荧光斑点物质、大极性（Rf＜0.4）抗氧化成分和酚胺类物质比土曲霉C23-3 纯培养提取物丰富多样；由图2中的F4和F5可知，枯草芽孢杆菌与土曲霉C23-3共培养提取物中大极性（Rf＜0.2）乙酰胆碱酯酶抑制成分比土曲霉C23-3 纯培养提取物丰富；由图2-E5中可知枯草芽孢杆菌与土曲霉C23-3 共培养提取物和枯草芽孢杆菌灭活菌体与土曲霉C23-3 共培养提取物中的酚胺类物质比土曲霉C23-3 纯培养提取物丰富。这些表明不同形式的共培养均可激活微生物的次生代谢，产生更丰富的活性物质。

图2 粗提物的薄层层析紫外、化学显色及TLC 生物自显影图像Fig.2 The UV,chemically colorization and TLC bioautography images of the extracts

2.3 抗菌活性 滤纸片法发现副溶血弧菌、枯草芽孢杆菌和胶红酵母纯培养提取物对土曲霉没有明显的抑菌活性，而土曲霉纯培养提取物对副溶血弧菌、枯草芽孢杆菌或胶红酵母均有显著抑菌效果（表1），抑菌圈平均直径均在18.0 mm 以上，这表明在共培养过程中，副溶血弧菌等添加菌在化学拮抗竞争方面处于劣势，而土曲霉在此方面为优势。

表1 各粗提物的抗菌生物活性Table 1 Antimicrobial activities of the extracts mm

而共培养物的活性表现显示，副溶血弧菌与土曲霉C23-3 共培养12 d 的提取物对副溶血弧菌的抑菌圈为11.3 mm，而培养24 d 时抑菌圈有18.3 mm；这说明在早期共培养下，较早在培养基上定植的副溶血弧菌有一定的生长，后接种的土曲霉生长受到抑制，可能存在营养竞争关系，但在培养后期副溶血弧菌生长受到土曲霉较强的抑制。而副溶血弧菌灭活菌体在与土曲霉共培养过程中，提取物的抗菌活性从12 d 时的18.0 mm 减弱到24 d 时的16.7 mm，这可能是由于其诱导物质具有一定的半衰期。上述现象在枯草芽孢杆菌灭活/活菌体与土曲霉共培养的实验中也被观察到，其灭活菌体对共培养物抗菌活性刺激作用的衰减尤为明显，从12 d 的20.7 mm 抑菌圈减弱到24 d 的12.0 mm。胶红酵母的灭活菌体对共培养物抗菌活性刺激作用随时间也有一定衰减，但活菌体与土曲霉的共培养物一直具有稳定且显著的抗胶红酵母活性，这表明在共培养体系中，胶红酵母一直处于受抑制的劣势。

2.4 HPLC 指纹图谱分析 利用HPLC 对各培养发酵代谢产物进行分析，共培养物中某微生物的特征代谢产物的存在与否及其产量可反映在共培养体系中2 种菌此消彼长的生长态势，这与上文中的培养提取物抗菌活性结果可互为印证。

由图3 中的A6、C6和D6可知，当培养12 d 时，其纯培养对应的特征代谢产物在活副溶血弧菌与土曲霉共培养体系中仍然存在，但产量明显低于纯培养物中的含量，这表明在共培养体系中弧菌有一定生长；同样，土曲霉的特征代谢产物丁内酯-I 产量低于纯培养对照说明其在共培养体系中的生长也受到抑制，双方存在营养或化学竞争，这与上文抗菌活性揭示的信息一致，考虑到丁内酯-I 的抗菌作用[12]，推测该化合物参与了土曲霉对共存菌的化学拮抗。值得注意的是，色谱峰面积显示灭活弧菌和土曲霉共培养体系中丁内酯-I 的产量比土曲霉纯培养高2.2 倍，比活弧菌-土曲霉共培养高7.8 倍。类似菌株生长竞争及灭活菌体更能促进土曲霉产丁内酯-I 的现象在枯草芽孢杆菌和胶红酵母与土曲霉的培养实验中也被观察到。

当培养至24 d 时，由图3 中的E6、G6和H6可知共培养体系中副溶血弧菌长势较弱，这与抑菌活性结果一致，而灭活/活菌两种共培养方式都无明显诱导土曲霉产生更多丁内酯-I 效果，这表明原来起作用的诱导物质可能已经失效。枯草芽孢杆菌在此时间点也有类似现象；而图3-E7显示了其纯培养24 d 时有丁内酯-I 色谱峰（由其保留时间16.9 min及紫外光谱确认），由于该化合物为典型的真菌代谢产物，推测此峰是样品提取时污染所致。而由图3-G8和图3-H8可知，在此时间点，胶红酵母的活菌更能刺激土曲霉中丁内酯-I 的产生，是土曲霉纯培养的1.4 倍。

另外，结果也显示，除了丁内酯-I 之外，共培养对于其他一些成分包括微量成分的产生也具有刺激作用。如培养12 d 时，保留时间1.2 min、1.9 min及11.4 min（经紫外光谱比较也为丁内酯类代谢产物）的峰在灭活弧菌菌体与土曲霉共培养物中的含量要显著高于活弧菌与土曲霉共培养以及土曲霉纯培养物，而该物质在弧菌纯培养中并不存在，这表明弧菌菌体信号物质激活了土曲霉中这些产物的代谢途径。而胶红酵母在12 d 及24 d 时，保留时间7.5 min 的峰在活酵母与土曲霉共培养体系中的含量要远高于灭活酵母与土曲霉共培养、土曲霉纯培养及酵母纯培养，值得注意的是在24 d 时，胶红酵母纯培养中也有少量该物质产生，说明该物质可能是酵母菌和霉菌两类真菌都可产生的物质，但活菌体相互作用大大促进了该物质产生。

图3 254 nm 下各粗提物的HPLC 指纹图谱Fig.3 The HPLC fingerprints recorded at 254 nm of the extracts

3 讨论

海洋微生物为适应高盐、低压、低营养等特殊生态环境，会产生结构新颖、活性显著的化合物，但在实验室培养条件下有些海洋微生物产生次级代谢产物的途径不表达或者表达被抑制[3]，科研人员为最大程度开发利用海洋微生物等天然资源，通过有效微生物共培养技术获得生物活性更显著、化学成分更丰富的次生代谢产物。如朱峰等[17]将来自南海红树植物的2 株内生海洋真菌共培养，从共培养提取物中提取分离到化合物2-甲基水杨酸和环（苯丙-苯丙）二肽，这2 种化合物在纯培养时未能得到。丁维嘉等[18]将来自南海红树林的内生真菌E33 和K38 共培养，从中分离纯化得到9 种化合物，其中的6 种化合物在纯培养时未能分离得到。Chen等[19]将一株淡水湖泊沉积物真菌土曲霉（Aspergillus terreus）分别与枯草芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌进行蒸馏水大米培养基上的共培养，发现共培养代谢产物中的真菌化合物 butyrolactones I-VI、terrein 和aspulvinone E 等12 个已知化合物产量相比真菌土曲霉纯培养时提高34 倍，且从共培养提取物中得到2 个新化合物isobutyrolactone II、4-O-demethylisobutyrolactone II 和1 个已知化合物N-(carboxymethyl)anthranilic acid，其中N-(carboxymethyl)-anthranilic acid 只在共培养条件下检测到，在真菌土曲霉单独培养时并没有检测到。

而本研究同时选取枯草芽孢杆菌（G+）、副溶血弧菌（G-）和胶红酵母（酵母样真菌）等3 种不同类型的耐盐菌株与海洋来源土曲霉在海水大米培养基中进行了共培养。发现1 个值得注意的现象，即将死的菌体（灭活的枯草芽孢杆菌、副溶血弧菌或胶红酵母）与土曲霉C23-3 共培养组时，相较于活菌体与土曲霉C23-3 共培养组以及土曲霉纯培养组，在培养至12 d 时土曲霉特征代谢产物丁内酯-I的产量，灭活菌体与土曲霉共培养组 ＞ 土曲霉纯培养组 ＞ 活菌体与土曲霉共培养组。推测灭活菌体中存在的某些信号物质能在一定时间内稳定存在并诱导土曲霉增强丁内酯-I 的产生，而活菌在此时间段内与土曲霉共培养时可能由于营养竞争等关系抑制土曲霉的生长及丁内酯-I 的合成。但当共培养时间延长至24 d 时，灭活菌体对于土曲霉产丁内酯-I 的影响因菌而异，或与活菌体效果接近（副溶血弧菌、枯草芽孢杆菌），或更弱（胶红酵母），推测与不同菌产生的诱导物质的半衰期或菌对大米培养基的生长适应性等有关。有前人报道丁内酯-I 是土曲霉的一种群体自感应信号分子，在菌丝生长后期具有促进孢子形成的作用[20]，对比本实验中12 d 的土曲霉纯培养物与死弧菌/芽孢杆菌/酵母菌和土曲霉的共培养物外观形态，可发现后者的孢子产量（棕色）要明显高于前者，这表明灭活菌体中的诱导物可能向土曲霉传递了类似“恶劣环境”的信息，土曲霉进一步通过分泌丁内酯增强了群体感应作用并产孢抗逆。

另外，也发现共培养对于其他代谢产物包括一些微量成分的产生也有较显著的激活作用，但添加枯草芽孢杆菌共培养诱导土曲霉次生代谢的整体效果没有上述Chen 报道的显著，这可能与所用的土曲霉及枯草芽孢杆菌菌株水平上的差异，以及培养的大米培养基成分（如盐度、大米种类）、发酵时间、温度等因素有关。

4 结论

本研究中TLC、活性自显影及HPLC 指纹图谱均显示不同类型的微生物与土曲霉共培养均可激活一些原本沉默的活性次级代谢产物。

在活菌共培养体系中，枯草芽孢杆菌、副溶血弧菌及胶红酵母在与土曲霉的化学拮抗中均处于劣势；而灭活菌体相对于活菌，在12 d 时对土曲霉特征代谢产物也是群体自感应信号分子丁内酯-I 的产生具有更强作用，而更长时间的死菌刺激优势不明显或减弱，这可能源于某些具有一定半衰期的信号物质，对于控制合适时间点以更有效进行诱导调控发酵提供了有益启示。推测这些物质是菌体灭活时产生的，但具体分子结构还有待深入研究。

除了形态观察外，菌株化学拮抗能力及HPLC指纹图谱变化也可为揭示共培养体系中菌株之间的消长态势提供丰富的信息，是共培养体系研究的有用化学手段。

综上所述，本研究为进一步挖掘海洋真菌潜力及抗老年痴呆等活性先导化合物的发现提供了基础。