分化诱导因子-3对黑色素瘤细胞增殖及趋电性的影响

轩辕玉洁， 吕媛， 赵三军， 高润池

(云南师范大学 生命科学学院，云南 昆明 650500)

分化诱导因子(Differentiation inducing factors，DIFs)最初是作为多细胞黏菌盘基网柄菌茎细胞分化的信号分子被鉴定出来，它们是一类可溶的扩散性的亲脂类烷基氯化物，主要由DIF-1及少量的DIF-2、DIF-3、DIF-4和DIF-5组成[1].研究发现，DIFs通过抑制哺乳动物肿瘤细胞的增殖并诱导或促进其分化来发挥抗肿瘤作用[2-9]，DIFs的抗肿瘤活力存在差异，其中DIF-3具有最强的抗肿瘤活力，此外，研究者们也合成了一些具有抗肿瘤活性的DIF衍生物[10].

目前，研究者对DIFs抗肿瘤机制的研究主要集中在调控细胞周期方面，例如，DIFs在肿瘤细胞中通过快速地增加细胞内的钙离子浓度发挥作用[11]；DIFs直接抑制钙调蛋白依赖的cAMP/cGMP磷酸激酶(PDE1)的活性和p-21激活的激酶1(PAK1)的活性[6]；DIF-3通过抑制Wnt/β-连环蛋白信号降低细胞周期蛋白D1 mRNA的表达[9]；DIF-1和DIF-3通过激活GSK-3β来降低细胞周期蛋白D1的蛋白水平[7,9,12]；DIF-1通过抑制ERK和STAT2信号抑制细胞的增殖[5,8]；以及DIF-3通过调节ROS-依赖的DRP1-调节线粒体的分裂，引起细胞的自噬[13]等等.然而，DIFs抑制肿瘤细胞转移的机制却并不清楚.

肿瘤细胞不受控制地快速生长导致其表面电荷发生明显改变，从而在肿瘤增生区与周围正常组织间存在电压梯度，由此产生稳定的直流电场，即肿瘤生物电场，且肿瘤组织的电流方向与周围正常组织相反[14].肿瘤生物电场不仅具有调控肿瘤细胞信号分子表达激活的作用，还能控制肿瘤细胞增殖和迁移[15-17]，肿瘤细胞在生物电场中发生的定向迁移现象被称为肿瘤细胞的趋电性，研究结果显示肿瘤生物电场很可能与肿瘤的生长、侵袭及转移具有密切的关系.因此，本研究通过探讨DIF-3对黑色素瘤细胞B16-F10趋电性的影响，试图从肿瘤生物电场方面揭示DIF-3抗肿瘤的可能机制，为抗肿瘤药物的研发提供新思路.

1 材料与方法

1.1 材料

细胞株：小鼠皮肤黑色素瘤细胞株B16-F10购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库.

主要试剂：DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶及CO2非依赖性培养基均购自Gibco公司；PBS缓冲液购自Athena Es公司；DIF-1、DIF-3、Br-DIF-1和二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司；青霉素/链霉素溶液购自上海源培生物科技股份有限公司.

1.2 B16-F10细胞培养

B16-F10细胞培养于含10% FBS的DMEM培养液中，置于37 ℃且5%CO2浓度的培养箱中培养.

1.3 MTT法检测 B16-F10细胞的增殖

取对数生长期的B16-F10细胞，用DMEM培养基(含10% FBS)重悬，将细胞浓度调至5×104个/mL，按每孔104个接种于96孔板，待细胞贴壁12 h后，分别加入不同浓度(0、10 μmoL/L、20 μmoL/L和30 μmoL/L)的DIF-1、DIF-3和Br-DIF-1，每个浓度做6个重复，并在特定的时间(24 h和48 h)用MTT法检测细胞量.按以下公式计算B16-F10细胞的存活比率：

存活比率(%)=

实验组OD值/对照组OD值×100%

1.4 划痕实验检测DIF-3对B16-F10细胞迁移的影响

在12孔板中培养并进行划痕实验，更换培养基以便除去悬浮细胞，拍照记录0 h时的划痕情况(记为scratch0).分别加入不同浓度(0、10 μmoL/L、20 μmoL/L和30 μmoL/L)的DIF-3，每个浓度3个重复，在37 ℃，5%CO2浓度的培养箱中培养24 h后，拍照记录划痕的情况(记为scratcht)，并用愈合率来表示细胞的迁移情况，具体计算公式如下：

划痕愈合率=(1-scratcht/scratch0)×100%.

1.5 趋电性实验、图像采集和数据分析

2 结 果

2.1 DIFs以浓度依赖方式抑制B16-F10细胞的增殖

为探究分化诱导因子或衍生物对黑色素瘤细胞B16-F10的抗增殖效果，实验选用DIF-1、DIF-3和Br-DIF-1三种分化诱导因子(或衍生物)分别处理细胞，并通过MTT法检测不同浓度药物处理后的细胞存活比率，从而反映药物对细胞增殖的抑制作用.结果如表1所示，DIF-1、DIF-3和Br-DIF-1都可以显著降低细胞的存活比率，且随着浓度增加和时间的延长，药物对细胞的作用越强,其中DIF-3的抑制效果最为明显.

表1 不同种类分化诱导因子对B16-F10增殖的影响

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.2 DIF-3以浓度依赖方式抑制B16-F10细胞的迁移

基于DIF-3对B16-F10细胞增殖具有显著抑制效果，因此实验进一步选用DIF-3来研究分化诱导因子对B16-F10细胞迁移的影响.通过比较不同浓度的DIF-3(10 μmoL/L、20 μmoL/L和30 μmoL/L，以不加药物为空白对照)处理后的划痕面积变化情况来反映药物对细胞迁移的影响.结果如图1A所示，与空白对照相比，10 μmoL/L的DIF-3处理24 h就可以显著抑制细胞的迁移，而且随着药物浓度的增加，细胞迁移距离也逐渐降低，说明DIF-3不仅对B16-F10细胞的迁移有抑制作用，而且还以浓度依赖的方式发挥作用.

A.划痕实验观察图 B.划痕愈合率统计

2.3 DIF-3对B16-F10细胞趋电性的影响

在机体中肿瘤细胞的侵袭以集体迁移为主[20].为探究DIF-3对B16-F10细胞趋电性的影响，分别对单细胞、成片细胞和单层细胞进行研究.实验都用20 μmoL/L DIF-3预处理单细胞、成片细胞和单层细胞，随后施加2 V/cm的直流电场，实时录像并分别对单细胞、成片细胞和单层细胞的趋电性运动情况进行分析.结果如图2(单细胞)、图3(成片细胞)和图4(单层细胞)所示，在直流电场刺激下，单细胞、成片细胞和单层细胞都具有明显的朝向阴极的趋电性运动；用DIF-3处理细胞后，单细胞、成片细胞和单层细胞在直流电场中仍然朝向阴极运动，但是运动速度降低.

A.单细胞趋电轨迹图;B.趋电性指标统计图

A.成片细胞趋电轨迹图;B.趋电性指标统计图

图420μmoL/LDIF-3对B16-F10单层细胞趋电性迁移的影响

Fig.4Effectof20μmoL/LDIF-3onthemonolayercellsgalvanotaxisofB16-F10

3 结 语

研究结果显示，DIF-1、DIF-3和Br-DIF-1都可以抑制黑色素瘤细胞B16-F10的增殖，且以DIF-3的抑制效果最好，这与之前报道的结果一致[2,4,7].DIF-3处理后单细胞、成片细胞和单层细胞在电场中的迁移方向都没有受到很大影响，但运动速度都不同程度地减小了,暗示DIFs的抗肿瘤机制有可能是通过肿瘤生物电场发生作用的，后期的研究将通过测定小鼠移植瘤周围肿瘤生物电场的变化情况以及肿瘤发生发展情况来探讨DIFs与肿瘤生物电场之间的具体关系.