犬炎症性肠病

陶 娅，殷邵杰，刘明江，李金贵

(1.扬州大学兽医学院，江苏 扬州 225009；2.江苏省动物重要疫病与人畜共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009)

炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)是一种可以影响人、犬、猫等物种的特异性、慢性、复发性的肠道疾病，多数累及回肠、直肠、结肠，常以肠黏膜固有层炎性细胞浸润为特点。IBD的发病原因目前认为与环境、免疫失常、遗传以及肠道菌群改变有关，也有研究认为IBD是一种自身免疫性疾病[1]。越来越多的研究表明，遗传易感性是IBD的主要决定因素，免疫调节紊乱是直接发病的表征，而肠道菌群失衡以及环境等因素则是诱因[2]。

1 犬IBD的主要特征

IBD通常包括溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn’s diseases,CD)，近年来炎性结直肠息肉(Inflammatory colorectal polyps,ICPS)也被认为是犬特发性IBD的一种新形式。UC病变多发于乙状结肠和直肠，可延伸至整个结肠，病灶局限于大肠黏膜及黏膜下层。病程漫长，常反复发作。临床主要表现为腹痛、腹泻、黏液脓血便等。CD在胃肠道的任何部位均可发生，但常发生于末端回肠和上行结肠。临床主要表现为腹部疼痛、大便次数增多、肛周病变、肠狭窄等。ICPS以结直肠部位出现多发或者单发息肉并伴随中性粒细胞浸润为特征。该病发生于犬，具有种特异性，近年来被认为是引起犬大肠腹泻的一个主要原因[3]。

2 IBD的病理机制

目前IBD的发病机制尚未完全明确，但大量研究表明，该病与免疫、遗传、环境以及肠道菌群失衡有关。外界环境卫生和刺激物的刺激，会导致犬肠道菌群多样性降低或失调，从而引起IBD的发生。研究表明，遗传因素是IBD发生的重要影响因素。IBD与多种基因有关，具有一定的遗传性[4]。在外界环境和遗传等多个因素的相互作用下，肠道菌群发生改变，肠黏膜对于肠道菌群的失调作出异常的免疫应答。这种异常的免疫应答导致大量的炎性细胞及介质产生，所产生的炎性细胞进一步对肠道屏障造成损害从而引起肠道的慢性炎症和组织损伤。

3 IBD与肠道菌群的关系

肠道菌群在长期进化过程中，由于机体的适应力和自然选择，菌群与宿主、环境之间始终都处于动态平衡状态，形成一个相互依存、相互制约的微生态系统。研究发现，肠道菌群与犬IBD的发生、发展之间的关联非常紧密。虽然迄今为止尚未发现某种特定细菌与IBD的发病直接相关，也没有确定IBD特征性的菌群变化，但已明确IBD患犬粪便菌群的组成与健康犬存在一定的差异，而且IBD病变越严重，患犬粪便中乳酸杆菌的比率下降越多[6]。

IBD通常以门栓菌和拟杆菌菌群减少，而变形杆菌菌群增加为特征。此外，梭菌中毛螺菌科和球状梭菌亚组(即XIVa和IV簇)的多样性减少也与IBD相关[7]。已有研究证明，梭菌中XIVa和IV簇具有促进调节性T淋巴细胞(Treg)发育的功能。肠道免疫稳态的维持和针对微生物抗原免疫反应的控制涉及多层次调控，其中CD4+Foxp3+Treg细胞发挥着重要的抗炎作用，Treg细胞连续高表达调节其发育和活性的转录因子Foxp3+。因此肠道梭菌中XIVa和IV簇的减少会降低肠道的免疫状态，从而引起慢性肠道疾病。

4 IBD标志物

目前对于IBD的评估主要是基于临床症状和疾病活动评分，但这种评估具有明显的局限性。在有些病例中，尽管患犬临床症状有所缓解，但仍存在明显的组织病理学炎症。因此，寻找能够评估临床变化并预测IBD患犬临床过程的生物标志物已成为近年来的研究热点。

4.1 巨噬细胞相关细胞因子 现已知肠巨噬细胞在维持肠道平衡中发挥了重要作用，但也促成了IBD的发生。巨噬细胞可分为2种类型：M1和M2巨噬细胞。M1巨噬细胞可诱导炎症反应；M2巨噬细胞发挥抗炎作用[1]。与其他组织中的常驻巨噬细胞相反，Toll样受体对于肠巨噬细胞最初炎症反应活化产生的刺激没有反应。这需要通过下调下游信号传导通路来获得这种无反应状态，并保护宿主免受炎症危害[8]。运用针对巨噬细胞相关的多克隆抗体(分化抗原簇、CD64、CD163、CD204、离子化钙结合速配分子1和主要组织相容性复合体II)进行免疫组化分析，结果发现，非IBD患犬胃肠道内以表达CD163和CD204的M2巨噬细胞在犬小肠绒毛区域占优势；而IBD患犬该区域M2巨噬细胞数量下降，只有表达CD64+的巨噬细胞数量有轻微增加。研究证明，M2巨噬细胞在维持犬胃肠道稳态和动态平衡中发挥重要作用[9]。

4.2 凋亡蛋白 T淋巴细胞对凋亡的抗性会使活化的肠道T淋巴细胞持续存在，从而产生过量的促炎介质并导致异常免疫应答，过量的促炎介质会引起组织破坏和肠上皮屏障功能受损，最终加剧肠黏膜炎症和临床症状[10]。虽然细胞凋亡由多种细胞信号控制，但其通过促凋亡和抗凋亡相关蛋白的平衡而紧密调节。通过免疫组织化学和TUNEL分析IBD患犬十二指肠、回肠和结肠固有层中的半胱天冬酶3(Caspase-3)和B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)的表达情况。结果发现与健康犬相比，IBD患犬结肠黏膜中Caspase-3的表达显著减少；IBD患犬十二指肠黏膜绒毛顶端和基底部Bcl-2的表达显著增多，而回肠绒毛顶部Bcl-2表达显著减少。IBD患犬小肠内T淋巴细胞在不同区域的凋亡情况不同，肠黏膜中Bcl-2/Caspase-3的比值增加促进了小肠T淋巴细胞对抗凋亡而持续存在，从而引起T淋巴细胞累积并产生慢性肠道炎症[11]。

4.3 嗜酸性粒细胞相关介质 嗜酸性粒细胞(Eosinophil)是多功能粒细胞，活化后能释放细胞因子、趋化因子和细胞毒性颗粒蛋白(脱颗粒)等多种介质，在调节先天免疫应答和适应性免疫应答中发挥关键作用。在炎症期间，活化嗜酸性粒细胞释放的细胞毒性颗粒蛋白如嗜酸性粒细胞阳离子蛋白、嗜酸性粒细胞过氧化物酶(Epx)和碱性蛋白质可导致组织损伤和功能障碍。使用Epx单抗检测IBD患犬，可发现患犬黏膜固有层下部区域脱颗粒嗜酸性细胞数显著增加，而未活化的嗜酸性粒细胞无明显差异；患犬黏膜固有层上部区域内的活化和未活化嗜酸性粒细胞均显著增加。治疗犬和正常犬肠黏膜固有层内活化的和未活化的嗜酸性粒细胞数无明显差异[12]。Epx为肠道活检组织标本嗜酸性粒细胞的定量和选择性评价提供了一种可靠的策略。

4.4 钙粒蛋白 钙粒蛋白主要是由活化的中性粒细胞、巨噬细胞来表达与分泌的。S100A12即钙粒蛋白C，属于S100/钙粒蛋白亚族[13]。S100A12释放进入细胞间隙后，作为晚期糖基化终末产物(AGEs)受体的配体，两者结合后可诱导持续的受体后信号通路，包括核因子-κB(NF-κB)的激活，跨膜AGEs的上调，导致炎性反应的扩大和持续。S100A12是人IBD的一个生物标志物，与正常人相比，IBD患者粪便、血清和肠黏膜内S100A12浓度增加[14]。钙粒蛋白的浓度随着标准的医学治疗而发生改变，测量患犬粪便和血清中的钙粒蛋白可以有效的评估肠道炎症。

5 治疗方法

近年来，尽管在犬IBD诊断方面取得了一定的进展，但对于该病尚未形成较好的治疗方案。IBD仍是一个难以治愈的疾病，现行的治疗方案主要在于最大程度地降低呕吐和腹泻的发作频率，减轻患犬的临床症状。目前，对于人和犬的IBD患者通常采取抗炎治疗，其中以皮质类固醇类药物为代表。但使用类固醇药物治疗的IBD患犬中有很大一部分产生了耐药性和明显的副作用，因此急需一种新的IBD治疗方法。

5.1 脂肪干细胞(ADSCs)疗法 使用脂肪来源的干细胞(ADSCs)的细胞疗法已被用于治疗人和狗的IBD。在内窥镜和组织学检查中，能明显观察到使用ADSCs治疗的IBD患犬症状得到改善[15]。给C57BL/6小鼠口服7 d的葡聚糖硫酸钠制备结肠炎小鼠模型，然后连续7 d向小鼠施用仅包含犬ADSC或犬ADSC CellSaic，结果发现，ADSC CellSaic组的体重和结肠长度得以恢复。组织学分析显示，ADSC CellSaic治疗减少了炎性细胞的数量并修复了溃疡。在体外试验中，未观察到犬ADSC CellSaic的致肿瘤性和一般毒性，这表明犬ADSC CellSaic对犬结肠炎具有治疗效果[16]。

5.2 丝氨酸蛋白酶 肠道通透性增加，屏障功能障碍是IBD的另一个特征[17]。肠上皮细胞(IEC)形成针对细菌、毒素和抗原的物理屏障来防止黏膜炎症和组织损伤。肠屏障由IEC连接而成，其连接方式包括紧密连接(TJ)、粘附连接(AJs)和桥粒。对于如何修饰紧密连接来维持屏障功能的理解可为该病的治疗提供方法。研究表明，添加丝氨酸蛋白酶会引起IEC顶端产生一个快速且持续升高的细胞间跨膜电阻，但机制不明。在犬IEC内，基质酶即内源性丝氨酸蛋白酶能增加细胞间跨膜电阻。通过siRNA技术敲除细胞的咬合蛋白基因可阻止丝氨酸蛋白酶诱导的细胞间跨膜电阻的增加。利用光漂白荧光恢复试验，可以发现丝氨酸蛋白酶在细胞膜上使咬合蛋白显著增加。肠上皮顶端暴露的丝氨酸蛋白酶或基质酶可通过增加咬合蛋白来提高屏障功能[18]，从而降低黏膜炎症和组织损伤。

5.3 糖皮质激素 鉴于IBD发病机制的假设，其治疗有2个主要目标：减少宿主的炎症反应并最小化抗原暴露。为实现这些目标，治疗方案包括免疫抑制药物，特定饮食和抗生素，然而并非每个IBD患者都需要这种方案。一般仅在中度或重度病例中使用硫唑嘌呤、环孢霉素等免疫抑制药物。硫唑嘌呤能够抑制T淋巴细胞的激活和RNA的合成。但硫唑嘌呤等药物引起的不良反应率高达20%，主要包括过敏反应、白细胞减少症等不良反应。在病情轻微的病例中，限制性饮食足以给予体征缓解。当炎性细胞浸润严重的时候，给以波尼松等糖皮质激素并辅助蛋白膳食可以更好地改善临床症状[19]。

6 展望

IBD是一种难治性慢性疾病，其确切发病机制尚不清楚，病程漫长常给患病动物带来极大的痛苦，但目前还没有开发出有效的IBD诊断和治疗方法。针对IBD患犬肠道菌群和标志物的深入研究有助于对发病机制的理解，也有望成为IBD的诊疗手段。