肝性脂肪酸结合蛋白基因单核苷酸多态性表达与NAFLD的相关性

姜华 高建鹏 胡阳 张志波 宋丹 王鑫

昆明延安医院消化内科（昆明650000）

非酒精性脂肪肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是世界上最常见的慢性肝病之一［1］，NAFLD与肥胖、炎症、胰岛素抵抗、2型糖尿病等代谢性疾病相似［2］，是肝脏代谢综合征的表现，其包括简单的非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver，NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）［3］、纤维化和肝硬化，甚至肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）。在欧洲，由于肥胖和衰老等风险因素，NAFLD的患病率逐年增加［4］。随访研究表明，NAFLD在普通人群中普遍存在，NAFLD的增趋势明显［5］。NAFLD与2型糖尿病有着密切的关系。然而，NAFLD发病和进展的确切机制仍不完全清楚［6-8］。

肝性脂肪酸结合蛋白（liver fatty acid-binding protein，FABP1）是脂肪酸结合蛋白（FABP）超家族的成员，其在肝实质细胞的胞质溶胶中大量存在。它通过影响脂肪酸的摄取，运输，线粒体氧化和酯化作为肝脏脂质代谢的关键调节剂［9］。FABP1在第94位（T94A）的苏氨酸（T）至丙氨酸（A）突变最初在2004年被确定［10］，FABP1 T94A变异蛋白的表达与NAFLD患病率的增加有关［11］。人类FABP1基因变异被证明与空腹血清胆固醇和三酰基甘油水平升高有关，这与增加有关心血管疾病，2型糖尿病和代谢综合征的风险［12］。鉴于较高的血清胆固醇和三酰基甘油也与NAFLD相关［13］。学者推测FABP1中的变异也可能归因于NAFLD的发展，肝脏FABP1的减少是对抗NAFLD的有效途径［14］。本研究探讨FABP1遗传变异与NAFLD易感性的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料及纳入标准研究人群包括2015年9月至2018年9月在本院就诊的80例非酒精性脂肪肝患者（年龄20～74岁）。患有以下任何疾病的患者被排除参与本研究：自身免疫性肝炎，药物性肝病，原发性胆汁性肝硬化和原发性硬化性胆管炎。在研究期间，从同中心招募了80例健康志愿者。本研究中进行的所有调查均按照1975年赫尔辛基宣言的指导方针进行，并根据当地医学伦理委员会批准的程序获得个人的书面同意。

1.2 人体测量和生化评估所有受试者在禁食过夜后的早晨进行完整的身体检查。检查包括人体测量，健康相关行为问卷调查和生化测定。BMI计算如下：BMI= 体质量（kg）/身高平方（m2）。在人体测量检查后抽取静脉血样。除肝功能测试外，还通过标准临床实验室技术测量总胆固醇，高密度胆固醇和低密度胆固醇，甘油三酯和血浆葡萄糖的水平。

1.3 基因型分析用DNAZOL（Invitrogen，Germany）从静脉血中提取基因组DNA。使用HapMap数据库中（http：//www.hapmap.ncbi.nlm.nih.gov）中的基因型数据来标记SNP。使用HaploviewV4.2软件的成对标记方法（http：//www.broad.mit.edu/mpg/haploview）来捕获SNP，其中设定最小次等位基因频率（minimum minor allele frequency，MAF）＞0.10且最小r2＞0.8。研究发现了两个标签SNP，其MAF大于10%（rs1545224 G/A，位于内含子3；rs2241883 T/C，位于外显子3），代表了HapMap数据库中的五个多态性位点（r2＞0.8）。接下来使用等位基因特异性MALDI-TOF质谱分析在Sequenom Mass Array iPLEX平台进行基因分型。使用Mass Array Assay Design Version 3.1软件（Sequenom，San Diego，CA）进行引物设计，并且根据iPLEX方案获得SNP基因型。

1.4 功率计算关联性分析的power取决于样本大小、指定的Ⅰ型错误水平以及患者和对照组的基因型频率。基因型频率取决于感兴趣等位基因的总体频率及其对疾病易感性的影响。利用Genetic Power Calculator对个体多态性数据的统计显著性结果的power值进行估计。基于本研究中的等位基因频率和样本量，研究结果表明，在显性模型下，rs1545224的power＞90%，rs 2241883的power＞80%。

1.5 统计学方法表型定量数据表示为均值±标准差。利用t检验，Pearson′s χ2或非参数 Mann-WhitneyU检验评估患者组和对照组之间临床特征的差异。用χ2试验检测正常人的Hardy-Weinberg平衡（HWE）。无条件单变量和多变量Logistic回归分析获得NAFLD风险的原始让步比（odds ratios，OR）及其95%置信区间（CI）。年龄、性别、婚姻、教育或入境状态、BMI、ALT和AST等混杂因素也被包括在多变量逻辑回归模型中。本研究使用Haploview 4.2软件构建单倍型。用基于R语言的Haplo.stats软件估计每个单倍型的OR值和95%CI［10］。使用SPSS 13.0进行上述统计分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般临床特征NAFLD患者与对照组在年龄、性别、婚姻、文化程度、接收状态等方面的分布差异无统计学意义（均P＞0.05）。与对照组相比，NAFLD 患者的 BMI、FPG、TG、TC、LDL-C、ALT和AST水平显著升高，HDL-C水平较低（均为PB05）。见表1。

2.2FABP1基因SNPs与NAFLD的关联SNP信息、等位基因频率和Hardy-Weinberg检验结果显示，NAFLD患者rs1545224 A和rs2241883C等位基因频率分别为0.498和0.229，对照组分别为0.439和0.198。在单变量分析中，通过置换试验进行多次比较校正后，对照组与NAFLD（P=0.012）之间的rs1545224等位基因频率存在显著差异。而rs2241883的等位基因频率在对照组和NAFLD患者之间没有显著差异（P=0.178）。所有的对照基因型频率符合Hardy-Weinberg平衡（均P＞0.05）。两种FABP 1基因多态性在NAFLD患者和对照组中的基因型分布及其与NAFLD风险的关系见表3。病例组与对照组基因型分布有显著性差异（rs1545224为0.007，rs2241883为0.047）。用非条件Logistic回归分析估计FABP1基因型与NAFLD风险的相关性。结果表明，经年龄、性别、婚姻、文化程度或接收状态、BMI、ALT、AST等因素调整后，rs1545224杂合的gA等位基因和纯合子，AA等位基因均为NAFLD的独立危险因素。特别是与GG纯合子等位基因者相比，携带杂合子GA和纯合AA基因型的人患NAFLD的风险以等位基因剂量依赖的方式（PTrend=0.025）显著增加（GA基因型OR=1.48，95%CI：1.09 ～ 2.00；AA基因型OR=1.63，95%CI：1.13～ 2.35）。当GA和AA基因型汇集在一起进行分析时还发现，和没有这个等位基因的个体进行比较，至少有一个rs1545224 A等位基因的个体的患病风险增加了1.52倍（95%CI：1.14～ 2.02，P=0.004）。 此外，rs2241883TC杂合子与NAFLD的发生风险显著相关（调整OR=1.34，95%CI：1.02 ～ 1.76，P=0.033）。然而与rs2241883TT纯合子相比，rs2241883CC纯合子与未显著升高的风险（调整OR=1.12，95%CI：0.60 ～2.09，P=0.722）相关。当将CT和CC基因型合并分析时，和没有这个等位基因的个体进行比较，至少有一个rs2241883 C等位基因的个体的患病风险增加了1.32倍（95%CI：1.01～ 1.71，P=0.039）。见表2、3。

表1 NAFLD患者和对照组的临床特征Tab.1 General data of patients with NAFLD and control Group x±s

表2 有关FABP1的两个基因分型SNP的信息Tab.2 Information about two genotypes SNP of FABP1

2.3 rs2241883和rs1545224SNPs对NAFLD的累积效应通过统计与NAFLD风险相关的基因型数来分析这两个SNP的风险基因型，检验FABP1与两个SNPs的可能累积效应。NAFLD病例的风险基因型往往高于对照组，有两种风险基因型的患者NAFLD风险显著增加（OR=1.65，95%CI：1.22～2.23），且随着风险基因数目的增加，NAFLD风险显著增加（P=0.001）。见表4。

3 讨论

许多研究表明，FABP1过表达增强了脂肪酸摄取，而FABP1基因消融则降低了肝脏脂肪酸摄取［15-16］。NAFLD是人类最常见的肝脏疾病［17］，虽然在啮齿类动物模型中，环境因素（如高脂肪饮食）和遗传因素都对NAFLD有影响，但是对于遗传机制在人类NAFLD中的作用知之甚少［18］。多项研究表明，编码人FABP 1基因在NAFLD中发挥重要作用［19］，人类NAFLD易感性或疾病进展与基因的关系，个体遗传变异对疾病易感性的影响仍不确定。

在本研究中，FABP 1上的两个标签SNPs（rs 2241883 T/C，第3外显子，在编码蛋白中出现T94A替换；rs1545224 G/A，内含子3）与NAFLD风险的关系。结果发现，rs1545224杂合子GA等位基因、纯合AA等位基因和rs 2241883杂合子TC等位基因与NAFLD风险显著相关。此外，在控制了潜在的混杂因素，如年龄、性别、BMI和其他变量后，由rs1545224 A和rs2241883 C变体组成的变异体与NAFLD的发病密切相关（P＜0.05）。因此，目前的数据显示，FABP基因多态性可能影响NAFLD的易感性。

表3 所选SNP的基因型与NAFLD风险之间的关联Tab.3 Association between genotypes of selected SNPs and NAFLD risk 例（%）

表4 FABP 1不利基因型对NAFLD的累积效应Tab.4 Cumulative effect of adverse genotype FABP 1 on NAFLD 例（%）

rs2241883 T/C SNP是FABP 1中唯一的编码SNP，并且能够导致中极性氨基酸残基苏氨酸（T）在FABP 1中变为小而疏水的丙氨酸（A）残基。这一变化已被证明与心血管疾病、2型糖尿病和代谢综合征的风险增加有关［20］。在本研究中，笔者发现rs2241883 T/C变化也与NAFLD有关。此外，笔者还发现rs2241883 TC/CC基因型与NAFLD患者较高的LDL-C水平，这与先前的发现一致。

FABP1是脂肪酸结合蛋白（FABPs）超家族成员之一，在肝实质细胞胞浆中含量丰富［11］。FABP是肝脏脂质代谢的关键调控因子，它影响长链脂肪酸（LCFAS）的摄取、转运、线粒体和过活受体α（pPARα）在追踪LCFAs至细胞核过程中的配体依赖性反式激活。结果表明，同时含有两个SNP风险等位基因的A-C单倍型与发展风险显著相关，表达的调节影响肝脏脂质储存，引起肝脂合成变化的原因。

FABP1基因多态性显示，具有两种风险基因型的个体NAFLD风险显著高于无风险基因型的个体，且随着风险基因型数量的增加，NAFLD的风险显著增加。这些结果提示这些变异可能在NAFLD的发生发展中发挥联合作用，具有风险型基因的个体具有NAFLD易感性。因此，研究FABP1基因多态性，探索NAFLD病因学特点，寻找NAFLD易感基因，提高对NAFLD发病机制的认识，从而将有可能从基因水平上成为NAFLD防治的新靶点，为该疾病的诊断与治疗提供新的途径，更有效降低NAFLD和心脑血管以及代谢性疾病发生，提高人们生活质量。

总之，关于FABP SNPs和NAFLD的该关联研究表明FABP RS2241883T/C、RS1545224G/A及其单倍型可调节NAFLD的风险。这一研究能使人们更好地理解与NAFLD发病机制有关的复杂机制。但这些FABP1变异体的存在有待于进一步的分子生物学和生化研究。