动物源性食品大环内酯类抗生素残留检测样品前处理技术研究综述

刘彦钊，张丽丽

(河南质量工程职业学院 食品与化工系, 河南 平顶山 467000)

大环内酯类(Macrolides)抗生素[1]是一类因具有14～16碳内酯环化学结构而得名的抗生素.一代大环内酯类抗生素由于副作用大，目前使用相对较少.20世纪70年代先后问世的罗红霉素、克拉霉素、氟红霉素、阿奇霉素等第二代半合成药物，与第一代比较，具有抗菌谱广、生物利用度高、对酸稳定、不良反应少、抗菌后效应明显等优点.由于耐药菌的不断出现，不易耐药的酮基大环内酯类第三代药物，如泰利霉素、喹红霉素已经上市，其结构由大环内酯类抗生素衍生而来，耐酸且抗菌作用增强，耐药性低.以泰地罗新、泰拉菌素、加米霉素为代表的大环内酯类第四代抗生素也已进入市场，此类抗生素特点为药效时间长，只适用于饲养周期长的牛、猪等大牲畜.畜牧业专用的大环内酯类抗生素品种如利菌沙、泰乐菌素、乙酰螺旋霉素、替米考星和托拉霉素等应用非常广泛[2].

1 样品前处理技术研究意义

随着大环内酯类抗生素在畜牧业中的广泛使用，不可避免地在饲养的动物体内残留，导致食物品质下降，更随食物链进入人体后对敏感体质人群造成各种不良反应[3-5].我国农业农村部、国家卫生健康委员会和国家市场监督管理总局2019年第114号公告颁布了国家标准《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》(GB31650-2019)，该标准已于2020年4月1日起正式实施，在该标准中规定了红霉素、吉他霉素、螺旋霉素等多种大环内酯类抗生素在牛、羊、猪、鸡等不同动物的肌肉、脂肪、肝、肾等不同组织中的最大残留限量(MRL) ；同时颁布的国家标准《食品安全国家标准 水产品中大环内酯类药物残留量的测定液相色谱-串联质谱法》(GB31660.1-2019)则制定了水产品中竹桃霉素、红霉素、克拉霉素等9种大环内酯类抗生素残留的国家标准检测方法.研究动物源性食品大环内酯类抗生素残留检测方法，一方面可以为国家制定与完善相应标准提供参考，另一方面对保障动物源性食品安全、保护人民大众生命健康具有重要意义.

目前大环内酯类抗生素的检测方法基本采用高效液相色谱法(HPLC)或高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)，这些方法中采用的检测仪器均具有卓越的灵敏度、高性能和高可靠性等特点；而动物性食品如肌肉组织、禽蛋、动物内脏、脂肪等样品成分复杂，导致样品中抗生素分离过程的干扰因素多、杂质去除难，需要深入研究样品前处理技术，以期能够快速、准确地对样品中残留的抗生素进行提取、富集，所以样品前处理是动物源性食品大环内酯类抗生素残留检测工作非常重要的基础性工作.样品前处理技术在大环内酯类抗生素残留分析中不仅最费时、费力、成本高，其效果好坏直接影响到方法的检测限和分析结果的准确性，而且还影响到分析仪器的工作寿命.本文综述了国内外近年动物源性食品大环内酯类抗生素残留检测前处理技术的相关文献，拟为进一步研究和开发快速、便捷、高效的前处理方法提供依据.

2 样品前处理技术研究综述

样品的前处理一般包括从样品中提取残留抗生素、浓缩提取液和去除提取液中干扰性杂质的分离净化等步骤，其目的是使样品经处理后更适合分析仪器测定的要求，以提高分析的速度、效率、准确度、灵敏度和精密度.目前常见的样品前处理技术有液-液萃取(liquid-liquid extraction, LLE) 、加压液体萃取(pressurized liquid extraction, PLE)、微波辅助萃取(microwave-assistcd extraction，MAE)、超声波辅助萃取(ultrasound assisted extraction，UAE)、固相萃取(solid phase extraction，SPE) 、磁固相萃取(magnetic solid phase extraction，MSPE)、在线固相萃取(online SPE)、分子印迹固相萃取法(molecularly imprinted solid phase extraction，MISPE)、 QuEChERS (quick，easy，cheap，effective，rugged，safe)等.

2.1 液-液萃取法

液-液萃取法[6]利用相似相溶原理，将一种或多种混溶的溶剂(即萃取剂)加入与之互不相溶的待测溶液中，通过振摇，静置或离心分层，将目标化合物转移到萃取剂而实现组分分离的样品处理方法.又称为溶剂萃取.王浩等[7]建立了液相色谱-质谱测定牛奶中包含大环内酯类抗生素在内的5类35种抗生素残留的检测方法，在Mcllvaine缓冲液的作用下，使用乙腈对抗生素进行提取，35种化合物的检出限均低于10.0 μg/kg,方法回收率可达70.1%～109.9%.液-液萃取法成本低、操作简单，但是步骤繁琐耗时，有机溶剂用量大且具毒性，不利于健康环保，在样品干扰物质含量较高时萃取效果不理想.

2.2 加压液体萃取法

加压液体萃取技术[8]是一种将高温高压条件与液体溶剂相结合来实现目标产物快速高效萃取的方法.与其他萃取方法相比，加压液体萃取是一种相对快速的操作过程，易于自动化并且溶剂消耗较低.EZZARIAI等[9]建立了使用超高效液相色谱-质谱联用(UHPLC/MS)测定源自污水污泥、棕榈废料和草的混合物的堆肥中的大环内酯类、四环素类和氟喹诺酮类抗生素残留的一种快速分析方法，使用加压液体萃取法从堆肥中提取抗生素，最终测得罗红霉素、金霉素、土霉素、依诺沙星和环丙沙星的回收率分别为24%～30%、53%～93%、33%～57%、69%～135%和100%～171%，效果令人满意.

2.3 微波辅助萃取法

微波辅助萃取[10]是指在微波作用下大大加快萃取速率的一种萃取方法.具体做法是将固体样品和有机溶剂加入到密闭容器中，让样品和萃取溶剂充分接触，然后用微波加热，使待测物在高温条件下被提取到有机溶剂中，加热的过程中可以通过调节微波加热的参数对目标物进行选择性萃取.用这种方法处理样品的优点是能在短时间内完成多种组分的萃取、萃取溶剂的用量少、重现性好、回收率高、易于实现自动化操作，是一种环境友好的样品前处理方法.这种技术是1986年由匈牙利学者GANZLER等[11]提出的，微波辅助萃取具有设备简单、适用范围广、萃取效率高、重现性好、节省时间、节省试剂、污染小等特点，表现出良好的发展前景和巨大的应用潜力.

ZHANG等[12]开发了一种可同时检测鱼肉中包含红霉素、克林霉素、泰乐菌素、替米考星、罗红霉素5种大环内酯类抗生素在内的54种药物的微波辅助萃取-液相色谱-串联质谱法，在最佳合成和提取条件下，检出限和定量限分别为0.01～0.50 μg/kg和0.05～2.00 μg/kg，回收率56.3%～119.9%，相对标准偏差0.3%～17.1%，萃取过程需12 min，该法简单、快速、环保、基质干扰小、富集系数高.

2.4 超声波辅助萃取法

超声波辅助萃取[13]是利用超声波辐射压强产生的强烈空化效应、机械振动、扰动效应、高加速度、乳化、扩散、击碎和搅拌作用等多级效应，增大物质分子运动频率和速度，增加溶剂穿透力，从而加速目标成分进入溶剂，促进提取的进行.超声波对固体样品的预处理很有利，它促进和加速了提取过程，如分散、均化、雾化、洗涤和衍生过程，而且还可避免高温对目标成分的破坏，方法操作简单，副产品少，目标物易分离，能达到比常规提取更理想的结果.

LORENZETTI等[14]建立了一种反相超声辅助萃取-电泳分析法测定鸡脂肪样品中的大环内酯抗生素的方法，该法在35～200 μg/kg范围内线性良好，相对标准偏差小于13%，替米考星和泰乐霉素的定量限分别为17.4～55.0 μg/kg和22.1～47.0 μg/kg，回收率为73%～117%.

2.5 固相萃取法

固相萃取法[15]是复杂样品前处理领域中广泛应用的一种技术，它能快速、简便、有效地除去各类样品中的杂质组分，并达到对待测组分分离和浓集的目的，大大缩短了样品的制备时间，克服了传统液-液萃取法耗时长、所需样品量大、易乳化、分离效果不佳等缺点，且随着该技术的进一步发展，SPE技术实现了自动化操作，便于处理大规模样品，在大批量样品的分析工作中应用越来越多.

王一涵等[16]建立了固相萃取净化/超高效液相色谱-串联质谱同时测定猪肉中14种大环内酯类药物残留的方法，样品先使用乙腈溶液提取，再使用固相萃取富集，14种抗生素的回收率均在71.1%～102%之间，方法准确可靠.CHEN等[17]自建了多孔芳香族骨架(PAF)，并使用该骨架作为固相萃取剂建立了一种液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)测定鸡肉样品中的6种大环内酯类抗生素的检测方法.在优化的条件下，该法对6种抗生素检出限为0.2～0.5 μg/kg，回收率为82.1%～101.4%，在食品安全分析和监测中具有测定大环内酯类抗生素的潜力.徐洁等[18]建立了Oasis HLB固相萃取小柱萃取(SPE)、高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)同时测定水中5种大环内酯类抗生素(罗红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、螺旋霉素和泰乐菌素)的分析方法，回收率在64.8%～90.8%之间，仪器检出限为0.012～0.085 μg/L，定量限为0.041～0.285 μg/L.

2.6 磁固相萃取法

磁固相萃取[19]是基于磁性纳米颗粒(MNPs)为固相吸附材料的一种前处理技术.该法具有富集倍数高、检出限低、线性范围宽、样品通量高和良好的抗干扰能力等特点，适合分析复杂基质样品中的痕量或超痕量抗生素残留.

秦烨[20]采用碱性溶液中共沉淀的方法制备了一种磁性石墨烯(G-Fe3O4)纳米材料，并将该磁性固相萃取剂用于水产品前处理，建立了水产品中大环内酯类抗生素HPLC-MS/MS残留检测方法，检出限0.41～0.52 μg/kg，定量限1.25～1.65 μg/kg，平均回收率为87.4%～98.2%，日内、日间精密度均小于8.5%.

2.7 在线固相萃取法

在线固相萃取技术[21]是一种新出现的前处理技术，此类装置通过一个六通阀将萃取装置和样品分析装置连接，通过六通阀的切换，依次进行样品前处理和分析过程.近年来，在线固相萃取技术开始被应用于大环内酯类抗生素检测的前处理.相对于一般的固相萃取法，在线固相萃取法具有固萃小柱可重复利用、洗脱有机溶剂耗量低、样品降解量低、自动化程度高、可早期预警和在线监测等优点.张晓光等[22]建立了在线固相萃取净化-液相色谱-串联质谱检测猪肉中10种大环内酯类抗生素残留的方法，样品提取后使用在线固相萃取柱(HLB柱)富集净化，回收率为69.6%～115.2%，检出限0.05～0.30 μg/kg，定量限0.10～1.00 μg/kg.

2.8 分子印迹固相萃取法

分子印迹固相萃取法[23-24]是以分子印迹聚合物作为固相萃取的填料，分子印迹固相萃取具体操作和传统固相萃取类似，主要包括柱子预处理、上样、淋洗和洗脱等步骤.该法克服了传统固相萃取技术特异性差等缺点，与免疫吸附材料具有相似的选择性，而且具有制备简单、稳定性好和可重复使用等优点.

SONG等[25]以甲基丙烯酸为功能单体，通过沉淀聚合法合成了特定类别的大环内酯分子印迹聚合物，该聚合物对于侧链具有不同空间排列以及不同内酯环大小的大环内酯类化合物，显示出不同的比吸附和印迹因子，在分子印迹聚合物固相萃取的基础上，建立了一种液相色谱-串联质谱法同时测定猪肉中七种大环内酯类抗生素残留的快速、选择性、重现性好的方法，加标浓度为5、10、25、100 μg/ kg时，七种大环内酯类化合物的平均回收率在68.6%至95.5%之间，日内和日间相对标准偏差低于8%.检出限和定量限分别为0.2～0.5和0.5～2.0 μg/ kg.

JI等[26]使用螺旋霉素作为模板，甲基丙烯酸作为功能性单体以及中孔MCM-41作为载体来制备了一种中空多孔分子印迹聚合物，在此基础上建立了一种HPLC-MS/MS同时测定阿奇霉素等七种大环内酯类抗生素的检测方法，回收率88.0%～117%，检出限低至3～17 ng/kg，表明该方法即使从复杂基质中选择性提取大环内酯类药物也具有优势.

洪月琴[27]以沉淀聚合方式制备以红霉素(ERY)和泰乐菌素(TYL)为模板,甲基丙烯酸(MAA)为功能单体,乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)为交联剂的复合模板分子印迹聚合物(MIP)，使用该分子印迹聚合物制作了MISPE分子印迹固相萃取柱，对样品进行前处理后采用毛细管电泳检测了替米考星、红霉素、克拉霉素、罗红霉素、泰乐菌素5种大环内酯类抗生素的残留量，回收率为75.3%～94.2%，富集倍数达2 825～4 540倍，检出限达到0.3～0.8 μg/L，因此制作的MISPE柱可以应用于牛奶样品的富集和净化前处理中.李爱芸等[28]以替米考星为模板分子、甲基丙烯酸为功能单体合成了替米考星分子印迹聚合物，并用该聚合物作为填料制成分子轨迹固相萃取枪头，对蜂蜜样品中的大环内酯类抗生素进行前处理后，采用高效液相色谱法进行分离检测，检出限和定量限分别为 14.2～71.6 μg/kg，回收率为 90%～110%.

2.9 QuEChERS法

QuEChERS 法[29]是Quick(快速)、Easy(简单)、Cheap(便宜)、Effective(有效)、Rugged(可靠/耐用)和Safe(安全)的缩写，是一种集以上优势于一身的样品前处理技术.QuEChERS实质是振荡法萃取、液液萃取法初步净化、基质分散固相萃取净化相组成所形成的一种样品前处理方法.衍生方法后有超声萃取、凝胶渗透色谱萃取等.一般从萃取溶剂、萃取方式、盐析剂和净化剂的选择等方面考虑QuEChERS技术在具体检测方法中的应用.该方法减少了溶剂及其他材料的使用，缩短了分析时间和成本，极大地满足了现代实验室的需求.

ZHOU等[30]采用一种改进的快速、简便、廉价、有效、稳定、安全的提取方法(QuEChERS)进行样品前处理，该方法采用反应曲面法(RSM)优化，建立了QuEChERS-高效液相色谱-串联质谱法(QuEChERS-HPLC-MS/MS)同时分析牛奶中16种大环内酯类抗生素和4种代谢物残留量的检测方法，回收率62.27%～115.28%，16种大环内酯类抗生素及4种代谢物在1～100 μg/L浓度范围内均能检测到，所有分析物的检出限和定量限分别为0.30～0.85 μg/kg 和1.1～4.0 μg/kg，日内和日间精度分别低于10%和15% ，该方法可应用于不同乳制品中大环内酯类抗生素及其代谢物的筛选.

汪建妹等[31]建立了QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法(QuEChERS-UPLC-MS/MS)同时测定有机肥中磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类46种抗生素的分析方法.46种抗生素在1～200 μg/L范围内线性关系良好，相关系数(R2)为0.996 6～0.999 9，在25、100、400 μg/kg加标浓度下，3类抗生素的回收率分别为67.8%～95.6%、65.6%～89.4%和66.6%～107.8%.

3 结论与展望

动物源性食品大环内酯类抗生素残留的特点是残留水平低，样品基质复杂，干扰物质多，不易从样品中分离、提纯.这就对样品进行净化和富集的前处理过程提出了很高的要求.样品前处理的结果将直接关系着整个检测的准确度与精密度.因而，有必要发展一种快速、灵敏、高效的样品前处理技术.

传统的前处理方法如液-液萃取等，操作繁琐、周期长，需要使用大量的有机溶剂，对操作者的身体健康和环境带来了不利影响.

固相萃取法(SPE)常采用一次性使用的可弃小柱，其填料一般为专门为样品处理设计的吸附剂，填料量相对较少，节省时间和溶剂，可以净化很小体积的样品，并且处理过程中不会产生乳化现象.而一般的SPE法的吸附剂对不同种类的抗生素并没有专一性，当样品成分复杂时易发生共萃取而难以满足复杂组分的分析要求.

分子印迹固相萃取法(MISPE)则是将分子印迹技术应用到固相萃取前处理过程中，通过开发具有特异选择性的高效吸附剂，简化了样品前处理过程，缩短了分析时间，使分析方法进一步精确可靠，MISPE将越来越广泛地应用于食品中大环内酯抗生素的残留检测.

大环内酯类抗生素残留检测的基质样品以动物源类基质为主，如动物组织肉、肝、乳制品等，饲料为其次.QuEChERS法之所以在大环内酯类抗生素残留检测领域迅速占有一席之地是因为其具有特殊的优势：可以根据不同基质和不同兽药的物理、化学性质通过调整提取溶剂、pH、盐类或稀释剂等来适应不同情况.QuEChERS对于高蛋白和基质更复杂的样品如肝脏等的应用还比较有限，所测试的药物也较有限.因此，开发新型的萃取剂和净化剂，扩大样品前处理的范围，QuEChERS必将在大环内酯类抗生素残留检测领域得到更广泛的应用.