茶树内生真菌的分离及广谱抑菌菌株的筛选鉴定

刘诗诗

(广西壮族自治区桂林茶叶科学研究所， 广西 桂林 541001)

植物内生真菌(endophyte)是指生活史的部分或全部阶段生活于健康植物各个组织和器官内部的真菌[1]。植物内生真菌可以产生与其宿主植物相同或相似的生理活性成分以及特殊活性物质，这些真菌对宿主植物几乎无害，与植物形成相互依存的共生关系或不太密切的共生关系[2]。近年来，一些具有特异功能的内生菌不断从植物中被分离出来，如高原等[3]从蒲公英中分离出内生真菌中菌株 PGY5对金黄色葡萄球菌有较强的抑制效果，其最小抑菌浓度值约为0.16 mg/mL，最小杀菌浓度值约为0.31 mg/mL，且对其他植物病原菌如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等也具有较明显的抑菌作用；施蕊等[4]从滇重楼中分离出98株内生真菌，其中部分内生真菌对供试植物土传病原菌立枯丝核菌、尖孢镰刀菌等有一定的抑制作用，平均抑制率达82%以上，PPC-78对尖孢镰刀菌的抑制作用较为明显，两菌对峙试验时，抑制率高达100.00%，其发酵液的抑制作用也达83.11%。

中国是茶叶生产和贸易的发源地，茶叶一直是我国重要的经济作物之一。国内对茶叶进行的研究主要集中在茶叶品质、栽培、组培、病虫害防治等[5]方面，近几年来，因为农药残留新标准的实施，对茶树病虫害的防治提出了新要求，越来越多的学者对防治茶树病虫害的同时又能提高茶叶品质进行了相关研究。目前已有研究表明，茶树各个组织内存在着独特的内生微生物菌群[6]，从这些内生菌群中已成功分离出能抑制茶病原菌的菌株，如胡淑霞[7]从茶树中分离出的芽孢杆菌对茶赤叶斑病、茶白星病及茶煤病有一定的抑制作用，其抑制率分别为74.87%、65.69%、55.67%；蔡丽等[8]从茶树中分离出的26株内生菌中，部分内生菌对枯草芽孢菌、金黄色葡萄球菌、梨腐烂病菌等有较强的抑制作用；姜微等[9]从油茶健康叶片中分离1株解淀粉芽孢杆菌J-3-1，该菌株对茶根腐病菌、叶枯病菌、炭疽病菌及软腐病菌均有拮抗活性，其抑菌圈半径分别为12.5 mm、16.8 mm、13.5 mm、13.4 mm。因此，笔者等从茶树不同组织器官中分离、纯化内生真菌，并对其进行初步的抑菌活性试验及其发酵液抑菌活性研究、鉴定，以期为应用茶树内生真菌资源防治病害奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试植物茶树品种为桂香18号，茶树根、茎、叶由广西桂林茶叶研究所提供。

1.1.2供试病原菌病原菌分别为火龙果黑斑病菌〔Bipolariscactivora(Petrak)Alcorn〕、香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp)、芒果蒂腐菌(BotryodiplodiatheobromaePat.)、小麦赤霉病菌(FusaHumgraminearumSehw)、苹果轮纹病菌(Botrysphuaeriaberengerianaf.sp.piricola)、番茄早疫病菌(Altemariasolani)和芒果炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioiles)，均由海南大学热带农林学院农药实验室提供，4℃保存备用。

1.1.3培养基

1) PDA培养基。去皮的200 g马铃薯切小块，加水煮沸直到土豆完全熟透，然后用4层纱布过滤后加入20 g葡萄糖、18 g琼脂，再定容至1 000 mL，121℃高压蒸汽灭菌20 min。分装时100 mL培养基中加入100 μL抗生素，即抗生素的添加比例为1%。

2) 孟加拉红培养基。31.6 g孟加拉红，28 g琼脂，加水煮沸至完全溶解，再定容至1 000 mL，121℃高压蒸汽灭菌20 min。分装时加入1%的抗生素。

1.1.4试验仪器电子天平(CAV213C，奥豪斯仪器(上海)有限公司)、超净工作台(SW-CJ-1FD，苏州净化设备有限公司)、数显多孔恒温水浴(BA-8，常州国华电器有限公司)、生化培养箱(SPX-280，宁波江南仪器厂)、微波炉(WD900G，佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司)、双人超净工作台(SW-CJ-2FD，苏州安泰空气技术有限公司)、凝胶电泳扩增仪(DYY-6B，北京六一仪器厂)、微生物摇床培养箱(ZHWY2102C，广东康恒仪器有限公司)、高压蒸汽灭菌锅(LD2X-30KA，上海申安医疗机械厂)。

1.2茶树内生真菌的分离及纯化

取茶树的根、茎、叶，用水冲洗干净去泥土，晾干。参照施蕊等[4]的方法进行表面灭菌，即用0.1%的升汞浸泡根8 min、茎5 min、叶3 min，无菌水反复冲洗；75%乙醇浸泡30 s，无菌水反复冲洗；处理完毕后在无菌条件下将根、茎、叶切成0.5 cm×0.5 cm的小块，分别放入PDA培养基中，做好标记，待培养基中有菌丝长出时，挑取前端菌丝接于另一新配置的PDA培养基中央，反复进行该步骤以实现纯化，最后将纯化菌株接种到试管斜面保存备用。

1.3活化病原菌

在无菌条件下，用已灭菌的接种环挑取保藏在试管中的病原菌尖端菌丝接于PDA培养基中，置于28℃恒温培养箱内培养备用。

1.4茶树内生真菌的抑菌活性测定

采用平板对峙培养法[10]，在无菌条件下，用打孔器(直径0.5 cm)沿着菌落边缘打取菌饼，将植物内生真菌与植物病原菌菌饼接于PDA平板上，直线上的两菌饼相距2.5 cm，同时以只接有内生真菌或病原菌的平板为对照，每个处理3次重复，置于28℃恒温培养箱内培养，每隔24 h观察1次菌落的生长情况，直到对照病原菌菌落长至平板的2/3时拍照并记录生长情况，计算抑菌效果。根据内生菌株的抑菌率，选择抑菌效果较好且广谱性较强的菌株制备发酵液，并进行发酵液抑菌活性测定。

式中，DCK为对照组菌落半径，D为处理组菌落半径，0.25为初始菌饼半径。

1.5优选内生真菌的生长速率测定

沿着菌落边缘打菌饼，以菌丝朝下接入培养基上，置于28℃的恒温培箱中培养，每隔24 h测量菌落半径，记录试验结果，分析内生真菌生长规律。

1.6优选内生真菌的形态学和分子生物学鉴定

1.6.1形态学鉴定 在无菌条件下，将筛选出的菌株接种于PDA培养基中，用镊子将已灭菌的盖玻片斜插入培养基中，在光学显微镜下观察该菌株的产孢结构、菌丝、孢子等形态特征，并拍照记录。筛选菌株接种于PDA平板中，置于28℃恒温箱中培养数天，观察菌落大小、颜色、形态、边缘等特征，依据《真菌鉴定手册》对该菌株进行初步的鉴定[11]。

1.6.2分子生物学鉴定 从已培养好的筛选菌株平板中刮取内生真菌菌丝，按照CTAB法[12]提取内生真菌DNA，使用ITS1和ITS4通用引物进行PCR扩增，按照表1所示反应体系，PCR反应条件：94℃变性5 min、58℃复性1 min、72℃延伸1 min、30个循环，PCR产物在琼脂糖(浓度为1 %)凝胶电泳，利用Goldview染色[13]对菌丝、孢子、分生孢子及孢子梗染色，经紫外分析仪观察拍照并保存，扩增产物经真菌基因组DNA提取试剂盒[14]纯化后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

表1茶树内生真菌DNA的PCR扩增反应体系

Table 1 PCR amplification reaction system of endophytic fungus DNA from tea trees

物质名称Material加入量/LAdding amountTemplate5Forward Primer1Reverse Primer110× Buffer52.5Mm dNTPs4DNA Polymerase1ddH2O33Total volume50

2结果与分析

2.1内生真菌的分离结果

从茶树中分离出内生真菌24株，从根中分离出7株，从茎中分离出8株，从叶中分离出9株，分别命名为G-1～G-7、J-1～J-8、Y-1～Y-9，分离的菌株生长情况及菌落特征见表2。

2.2内生真菌的抑菌效果

从表3看出，24株内生真菌中，J-7对芒果蒂腐病、香蕉枯萎病、芒果炭疽病、苹果轮纹病、火龙果黑斑病及番茄早疫病的抑制抑菌效果较好且广谱性较强，抑制率分别为70.14%、75.76%、75.86%、80.16%、85.59%和93.18%。

表2 茶树内生真菌的生长情况及菌落形态

注：“+”表示生长情况较弱，“++”表示生长情况好，“+++”表生长情况较好。

Note: "+" indicates weak growth, “++” indicates good growth, and “+++” indicates perfect growth.

表3茶树内生菌对各病菌的抑制率

注： G-1～G-7为茶树根部内生真菌，J-1～J-8茶树茎内生真菌，Y-1～Y-9茶叶内生真菌。同列数据后不同小写字母表示差异达0.05的显著水平。

Note:G-1～G-7 is an endophytic fungus at the root of tea tree, J-1～J-8 is an endophytic fungus at the stem of tea tree, and Y-1～Y-9 is an endophytic fungus in tea leaf. Different lowercase letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level.

2.3内生真菌J-7对植物病原菌的抑菌效果

从图1看出，J-7对供试病原菌有明显抑制作用，对番茄早疫病菌、火龙果黑斑病及苹果轮纹病的抑制作用较为明显。

2.4内生真菌J-7生长速率和形态学特征

茶树内生真菌在PDA培养基上前5 d生长较快，6～9 d生长逐渐缓慢，10 d以后几乎停止生长。

从图2看出，J-7菌落近圆形，前期菌丝毛绒状，白色，较致密，后期菌落底部中间呈褐色，凹凸不平，由内至外颜色逐渐变浅，有色素扩散圈。菌丝有明显的隔膜，多分枝，孢子梗呈梢子状，孢子呈镰刀状(图3)。

图1内生真菌J-7对各植物病原菌的抑菌效果

图2J-7的菌落形态

图3J-7的孢子梗(A)及菌丝(B)、孢子(C)形态

2.5内生真菌J-7分子生物学鉴定

从图4看出，J-7基因组DNA经过PCR扩增后在750 bp左右得到清晰的PCR扩增产物带。在GeneBank基因库中进行其同源性搜索，发现J-7菌株与镰刀菌属ITS序列相似性接近于90%。综合同源性比对结果和该镰刀菌在真菌发育系统中的位置，从Genebank中选出7个菌株的ITS基因序列，应用软件进行多重比较后构建系统发育树(图5)。从图中看出，该菌株与镰刀菌(Fusarium.sp)在一个分支中，与该菌株的进化距离最接近，初步将菌株J-7鉴定为镰刀菌属(Fusarium.sp )。

注：1，2为菌株J-7的DNA，M为Marker

Note: 1, 2 are DNA of strain J-7, M is Marker.

图4J-7的PCR扩增产物带

Fig.4 PCR products of J-7

图5基于rDNA ITS序列的系统发育树

3结论与讨论

试验采用普通的分离方法从茶树的根、茎、叶不同组织中得到了24株内生真菌，有7株来源于根、8株来源于茎、9株来源于叶，结果与游见明等[15]从茶树中分离出的32株内生真菌有一定差异，可能是研究材料的来源不同或笔者等的灭菌时间差异导致[16]。将24株内生真菌分别与火龙果黑斑病、香蕉枯萎病、芒果蒂腐病、小麦赤霉病、苹果轮纹病、番茄早疫病、芒果炭疽病、芒果炭疽病进行拮抗活性测定，筛选出了1株来源于茎的内生真菌J-7，该菌株对参试大部分病原菌有明显抑制效果，为广谱性内生真菌，其对番茄早疫病的抑制效果较为明显，对芒果蒂腐病、香蕉枯萎病、芒果炭疽病、苹果轮纹病、火龙果黑斑病、番茄早疫病的抑制率分别为70.14%、75.76%、75.86%、80.16%、85.59%和93.18%。采用形态学鉴定方法和分子生物学鉴定方法对J-7菌株进行初步的鉴定，该菌株属镰刀菌属(Fusarium.sp)。