粳型恢复系C418转基因再生体系的建立

张晓磊， 韦永贵， 董卓娅， 孙宏伟， 罗 龙

(文山州农业科学院， 云南 文山 663099)

水稻(OryzasativaL.)原产于中国，是全球最重要的粮食作物之一。高产优质及强抗逆性是水稻育种的主要目标，随着科学技术的进步，利用基因工程技术选育高产抗逆新品种成为保证和提高水稻产量的重要技术之一。水稻基因转化能否成功的关键在于选择和建立良好的植物受体系统。20世纪90年代初，HIEI 等[1]首次利用农杆菌介导法实现对粳稻的高效转化，农杆菌介导法进入水稻遗传转化的实用阶段。由于农杆菌转化取决于外植体培养所得的愈伤组织质量，愈伤组织的诱导状态直接决定水稻遗传转化的效率。因此，在水稻育种中，愈伤组织诱导是建立水稻转基因再生体系中最基础的环节。郭丽[2]以水稻成熟种子为材料研究不同培养基、不同浓度激素及不同激素配比多种因素对水稻愈伤组织的形成及生长状态的影响，结果显示，常规培养基(N6、B5)无法满足水稻生长所需的营养，组合培养基(NB、MS)诱导的愈伤组织出愈率高，生长状态好。韦新宇等[3]研究表明，水稻基因型及培养基中添加的激素含量、激素类别及配比均影响水稻愈伤组织诱导。唐轩等[4]采用农杆菌介导法将外源基因导入粳稻中，成功获得转基因体系。目前，在水稻愈伤组织诱导的研究方面，组合培养基与常规培养基的对比试验仅有小范围分析，不利于水稻愈伤组织培养条件优化。鉴于此，笔者等拟通过扩大范围比较不同培养基对水稻愈伤组织诱导的影响，优化水稻愈伤组织的培养，为后续水稻再生体系的建立提供有利条件。研究通过植物组织培养技术和农杆菌介导法建立水稻转基因再生体系，分析不同2,4-D浓度和不同诱导培养基对水稻成熟胚诱导的影响，建立粳型恢复系C418转基因再生体系，以期为水稻转基因育种和突变体库的建立创造有利条件。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1水稻材料北方骨干粳型恢复系C418，早熟中粳类型，四川农业大学作物遗传育种重点实验室提供， 于-20℃冰箱保存。

1.1.2试剂及菌株2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)植物生长调节剂，4℃避光存放。含目的质粒的农杆菌菌株pCAMBIA1301，-80℃冰箱保存，四川农业大学作物遗传育种重点实验室保存并提供。

1.1.3培养基7种基础培养基(N6、MS、MSN、NMB、NB、MB和NBD)，继代培养基(N6+2 mg/L 2,4-D，pH 5.8)，悬浮培养基(AA大量+MS微量+AA有机+铁盐+L-Pro+CH+suger，pH 5.2)，共培养基(N6大量+N6微量+N6有机+铁盐+CH+suger+葡萄糖+phy+2,4-D，pH 5.2)，筛选培养基(N6大量+B5微量+B5有机+铁盐+L-Pro+CH+suger+ phy+2,4-D+Cef+Amp+潮霉素，pH 5.2)，预分化培养基(N6大量+B5微量+B5有机+铁盐+ L-Pro+CH+suger+phy+2,4-D+6-BA+NAA+ABA+潮霉素，pH5.2)，分化培养基(N6大量+B5微量+B5有机+铁盐+L-Pro+CH+suger+ phy+2,4-D+6-BA+NAA+IAA+KT+潮霉素，pH 5.2)，YM培养基(微生物培养基，0.15 g/L KH2PO4+10 g/L甘露醇+Glu+NaCl+MgSO4+Yeast extract)，LB液体培养基(含75mg/L Kan+50mg/L Rif)。所有培养基均在HVE-50高压灭菌锅113℃灭菌20 min。

1.2试验方法

1.2.1外植体灭菌处理将粳型恢复系C418水稻籽粒用砻谷机去除外壳，选取具完整胚的籽粒作为外植体，放入已灭菌的250 mL锥形瓶中，在超净工作台进行外植体灭菌。先用75%酒精消毒1 min，无菌去离子水冲洗1遍；再分别用1.5%和2.5%次氯酸钠处理20 min，期间3～5 min摇动1次或封口放恒温振荡培养箱(100 r/min)。外植体用无菌去离子水冲洗5～7遍，封口前和解封后将锥形瓶瓶口在酒精灯外焰下灭菌，确保外植体灭菌过程无污染。最后将处理好的水稻成熟胚(外植体)置于已灭菌带滤纸的培养皿，干燥后进行后续接种。

1.2.2成熟胚愈伤组织的诱导接种前用75%的乙醇溶液对台面及所需器具消毒，将消毒好的器具在酒精灯外焰下烘干。用镊子挑取已灭菌外植体接种于不同培养基(7种基础培养基)分别添加不同浓度2,4-D(1.0 mg/L、2.0 mg/L和3.0 mg/L)的诱导培养基，每皿接种水稻成熟胚为25～30粒，5次重复。接种结束封口，置于相对湿度60%、温度(28±1)℃的恒温恒湿培养箱暗培养10～14 d。记录出愈数及愈伤生长状况，计算愈伤诱导率。

1.2.3水稻愈伤组织的继代将愈伤组织用已灭菌的镊子挑出接种于继代培养基(N6+2 mg/L 2,4-D，pH 5.8)，置于相对湿度60%、温度(28±1)℃的恒温恒湿培养箱中暗培养10 d。

1.2.4水稻愈伤组织的转化

1) 农杆菌悬浮液的制备。参照吴仙花[5]的方法，将农杆菌菌株pCAMBIA130划线于农杆菌培养基(YM培养基+LB培养基)平板上，28℃培育2 d。选择适度大小的白色单菌落，用已灭菌的枪头挑菌，接种于10 mL YM液体培养基中，在28℃、250 r/min振荡培育至OD600值0.5。然后吸取培养液1 mL接种于100 mL LB液体培养基中，于28℃、250 r/min振荡培养至OD600最佳值0.8(OD600值不可超过1.0)。摇菌后，准备2个已灭菌的50 mL离心管，倒入30 mL LB液体培养基，室温下4 000 r/min离心15 min，倒掉上清液，加1 mL LB液体培养基于离心管中，用空枪吹悬浮沉淀的菌体，冲洗细菌。移入50 mL离心管中，再加30 mL LB液体培养基，室温下4 000 r/min离心15 min，去掉上清液。最后加入终浓度为100 μM的As(乙酰丁香酮)，用LB液体培养基稀释菌体直至OD600值为0.4左右，获得农杆菌悬浮液。

2) 水稻愈伤组织的共培养。将经继代培养的愈伤组织(直径保持0.5 cm左右)放入农杆菌悬浮液中，摇床摇30 min，倒掉液体。将愈伤组织置于已灭菌带滤纸的培养皿，干燥后接种于共培养基，暗培育2～3 d。

3) 抗性愈伤组织筛选。将共培养后的水稻愈伤组织收集于已灭菌的250 mL锥形瓶，用无菌水洗8～10遍。瓶中留100 mL无菌水，加入2 mL 500 mg/L头孢霉素，100 r/min振荡30 min。倒掉无菌水，将愈伤组织置于已灭菌带滤纸培的培养皿，无菌工作台静置1～2 h，待愈伤组织表面水分完全蒸发后接种于含50 mg/L氨苄霉素与50 mg/L潮霉素的筛选培养基上，(28±1)℃暗培养3周。

4) 愈伤组织的分化、生根及移植。将所得的抗性愈伤组织接种于预分化培养基上，置于相对湿度60%、温度(25±1)℃的恒温恒湿培养箱中暗培养3周，接种于分化培养基上(光照16 h/d，光强为2 000 lx)，待再生苗长至5 cm左右转移到生根培养基。当再生苗根系强健时将其移栽到含有N、P、K营养成分的盆中，置于温室培养至植株成熟。

1.2.5相关指标计算愈伤诱导率=(长愈伤的成熟胚数/接种成熟胚数)×100%，愈伤分化率=(出小苗的愈伤组织数/接种愈伤组织数)×100%，外植体污染率=(被污染成熟胚数/接种成熟胚数)×100%。

1.2.6 数据统计分析使用SPSS20.0软件进行数据统计分析。

2结果与分析

2.1次氯酸钠浓度对外植体污染率的影响

不同浓度次氯酸钠对水稻成熟胚外植体的灭菌效果存在差异。2.5%次氯酸钠处理的外植体，其污染率为11.55%，而1.5%次氯酸钠处理外植体的污染率为24.68%。说明，高浓度次氯酸钠对外植体的灭菌效果优于低浓度。

2.2培养基与2,4-D浓度对水稻愈伤诱导的影响

2.2.1培养基单因素影响NBD、MSN和N6愈伤诱导效果较好，诱导率分别为81.07%、72.70%和69.67%，三者间差异不显著；NMB、MS愈伤诱导效果一般，诱导率分别为66.87%和66.40%，显著低于NBD、MSN和N6；NB 和MB愈伤诱导效果最差，诱导率分别为58.40%和50.13%，显著低于其余培养基。

2.2.22,4-D浓度单因素影响2,4-D浓度为2 mg/L和3 mg/L的愈伤诱导率分别为76.73%和69.06%，二者间诱导率差异不显著；2,4-D浓为度1 mg/L的愈伤诱导效果效果较差，诱导率为53.69%，显著低于浓度为2 mg/L和3 mg/L的处理。

2.2.3培养基与2,4-D浓度互作影响方差分析表明，不同培养基+不同浓度2,4-D对外植体愈伤诱导效果不同，两者的互作效应达显著水平。NBD培养基+3 mg/L 2,4-D处理的愈伤组织诱导率最高，达90.38%，且愈伤组织生长状态最佳。

2.3农杆菌介导的水稻愈伤组织转化效果

继代培养所得的优良愈伤组织经农杆菌介导进行遗传转化表明，共培养2 d时获得的抗性愈伤组织最多(图1)，愈伤组织转化率达80.76%；共培养3 d时，多数愈伤组织在筛选培养基上生长缓慢，逐渐褐化死亡，仅少数愈伤组织可以获得抗性愈伤组织，愈伤组织转化率为42.31%。

注：a愈伤组织在共培养基；b、c为抗性愈伤在筛选培养基(b为共培养2 d；c为共培养3 d)

Note: a, calli cultured on co-medium; b and c, resistant calli on screening medium for 2 d and 3 d respectively

图 1水稻愈伤组织的转化

Fig.1 Transformation of rice calli

2.4抗性愈伤分化效果

在筛选培养基中使用1 000 mg/L头孢霉素+50.0 mg/L潮霉素时，抑制农杆菌的生长，愈伤组织分化率为53.78%，而500 mg/L头孢霉素+50.0 mg/L氨苄霉素+50.0 mg/L潮霉素愈伤组织分化率为71.25%。即较高浓度头孢霉素抑制水稻愈伤组织的分化，通过降低头孢霉素浓度并添加适宜浓度氨苄霉素，可明显提高愈伤组织分化率。

3结论与讨论

3.1诱导培养基及其生长素2,4-D浓度的选择

研究表明，在相同培养环境下，NBD诱导培养基的水稻成熟胚愈伤组织诱导率最高，达90.38%；MSN和NMB愈伤组织诱导率较好，诱导率分别为88.01%和84.98%；N6和MS培养基的愈伤诱导效果一般，诱导率分别为72.88%和64.42%；NB 和MB愈伤诱导效果最差，诱导率分别为43.91%和38.80%。刘国宝等[6]采用NMB和MS培养基诱导水稻成熟胚表明，NMB培养基愈伤组织诱导率高于MS培养基，且愈伤组织质量优于MS培养基，与该研究结论不一致，可能与不同水稻品种的外植体有关。在不同浓度激素条件下，2 mg/L 2,4-D浓度水稻成熟胚愈伤组织诱导率最高，为76.73%，3 mg/L 2,4-D和1 mg/L 2,4-D的诱导率分别为69.06%和53.69%。不同培养基和不同浓度激素配比对水稻成熟胚愈伤组织的诱导均存在影响[3]，培养基与2,4-D浓度存在显著的互作效应，其中以NBD培养基添加3 mg/L 2,4-D处理的粳稻C418成熟胚愈伤组织诱导率最高，达90.38%，且愈伤组织生长状态最佳。

3.2水稻愈伤组织转化和分化条件的优化

KAWATA等[7-8]研究显示，水稻成熟胚外植体愈伤组织共培养2 d时获得的抗性愈伤组织最多，之后随共培养时间延长多数愈伤组织生长缓慢，并逐渐褐化死亡。粳稻C418成熟胚外植体愈伤组织共培养2 d时获得的抗性愈伤组织最多，共培养3 d时接种于筛选培养基中的多数愈伤组织生长缓慢，并逐渐褐化死亡，仅少数愈伤组织可以得到抗性愈伤，与前人的研究结果一致。NISHI等[9]研究发现，在接种筛选培养基之前，干燥处理可抑制农杆菌生长和繁殖，提高抗性愈伤组织的获得率；同时，抗生素添加类别对水稻愈伤组织的分化具有较大影响。在筛选培养基中使用1 000 mg/L头孢霉素+50.0 mg/L潮霉素时，抑制农杆菌的生长，粳型恢复系C418成熟胚愈伤组织的分化率明显低于500 mg/L头孢霉素+50.0 mg/L氨苄霉素+50.0 mg/L潮霉素处理，说明，较高浓度头孢霉素抑制水稻愈伤组织的分化。通过降低头孢霉素浓度并添加适宜浓度氨苄霉素，可明显提高愈伤组织分化率，结论与前人研究基本一致。

3.3建立粳型恢复系C418转基因再生体系

通过培养基类型、激素浓度、共培养时间及抗生素种类的最佳组合，成功建立北方骨干粳型恢复系C418转基因再生体系,即水稻外植体经次氯酸钠处理后接种于诱导培养基NBD+3 mg/L 2,4-D，获得愈伤组织，再用农杆菌悬浮液(含目的基因)侵染愈伤组织，初步获得转基因植株。