农用硫酸链霉素对烟草青枯病拮抗菌发酵液活性影响

黄保宏， 沈守国, 杨婷婷

(1.安徽科技学院 农学院，安徽 凤阳 233100；2.霍山职业学校，安徽 霍山 237299)

烟草青枯病由青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的一种危害重大、毁灭性强、分布极广的土传性细菌病害[1]，在浙江、福建、河南、辽宁等大部分烟草种植区均有发生，已对烟草生产造成严重威胁。烟草青枯病菌主要通过伤口侵染烟株，罹病烟株典型症状是发病部位一侧叶片枯萎但仍是绿色，其茎部常见褪绿条斑，且发病根部一侧根须变黑腐烂，另一侧根须大部分正常[2]，故呈“青枯”状；发病中后期叶片全部萎蔫黄化，根部完全变黑，用力挤压发病株茎切口，会有黄白色菌脓出现，病株茎和叶脉导管变黑[3]。而且带菌土壤和田间病残体是烟草青枯病菌主要越冬场所[4]。因此，在烟苗栽种时应避免对烟株造成伤口，并及时处理田间土壤和病残体，避免传染病害。

利用拮抗菌防治病害已成为近年来研究的热点[5]，其具有对人畜无副作用、环境兼容性好、材料来源广泛等特点。国内外学者对烟草青枯病防治提出了很多有效的防治措施，生物防治成为烟草绿色防控流行趋势之一。其中，利用拮抗菌防治青枯病越来越受到重视。

目前，有关运用农用抗生素与拮抗菌联合防治研究较为少见，本试验中将农用硫酸链霉素与青枯病拮抗菌发酵液等两种抗生素按不同体积比例混合，以探究农用抗生素对烟草青枯病拮抗菌发酵液联合抑菌作用，筛选适合安徽省优质烟区的抗生素资源，为烟草青枯病的生物防控提供依据，开发出防治烟草青枯病的新思路。

1 材料与方法

1.1 供试培养基

NA培养基：牛肉粉3.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化钠5.0 g，琼脂15.0 g，pH值7.3，H2O 1 000 mL，121 ℃灭菌。

1.2 试验器材

YKZ智能人工气候箱(浙江托普仪器有限公司)；XQY-LS-60-SII立式蒸汽灭菌箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；101A-3d洁净工作台(上海比郎仪器有限公司)；SW-OJ-2F旋转蒸发仪(宁波江南仪器厂制造)；JC5012台式恒温培养振荡器(上海市安亭电子仪器厂)；SW-QJ-2F分析天平(宁波江南仪器厂制造)。

1.3 供试菌株与农用抗生素

供试烟草青枯病菌、拮抗菌AKJK-2013-02均由安徽科技学院植物保护学实验室提供；72%农用硫酸链霉素(成都惠普生物工程有限公司)。

1.4 烟草青枯病拮抗菌拮抗物质粗提液的制备

在28 ℃条件下，将5 mL拮抗菌AKJK-2013-02接种到装有NA液体培养基的摇瓶中培养3 d，常温下以8 500 r/min离心0.5 h培养，提取其上清液，再用孔径5 μm微孔滤膜过滤后放在500 mL的棕色广口瓶中置于冰箱，在4 ℃条件下保存备用。

1.5 农用硫酸链霉素对烟草青枯病拮抗菌发酵液抑菌活性的测定

采用平板对峙法[5]测定，于2017年5月3日设置6个处理(V农用硫酸链霉素︰V拮抗菌发酵液=5∶0、4∶1、3∶2、2∶3、1∶4、0∶5)，将这6个处理分别混合摇匀后，倒入融化的5 mL NA培养基中，待培养基凝固后进行平板拮抗试验，以不加农用硫酸链霉素和烟草青枯病拮抗菌发酵液为对照(CK)，3次重复/处理。用直径5 mm打孔器将待测烟草青枯病菌菌落打成小圆饼，反放在直径9 cm培养皿中央并倒置在28 ℃恒温箱内培养，于第3、5、7天分别观察青枯病菌菌落的生长形态，并测量菌圈直径，计算抑菌率。

1.6 盆栽试验测定农用硫酸链霉素与拮抗菌AKJK-2013-02混合液的抑菌活性

2017年5月17日，将按V农用硫酸链霉素∶V拮抗菌发酵液= 5∶0、4∶1、3∶2、2∶3、1∶4、0∶5等比例摇匀配制成混合液进行盆栽试验, 以不加农用硫酸链霉素和烟草青枯病拮抗菌发酵液的为对照(CK)。3次重复/处理，3株烟苗/重复，用无菌土培育烟苗直至3叶期进行花盆移栽[6]。移栽后采用灌根接种的方法，将上述6个处理的混合液灌入染病烟株根际，放置于温室28～35 ℃条件下培养。观察第10、15、20天烟株发病情况，计算发病率和病情指数，并计算相对防效[7]。

植物发病率=(染病株数/调查总株数)×100%；

植物病情指数=[∑(各级病株数×相应级数)/调查总株数×最高级别值]×100%；

相对防效=[处理前病情指数×(1+对照区病情指数增长率)-处理后病情指数]/处理前病情指数×(1+对照区病情指数增长率)×100%。

1.7 数据处理

使用Excel 2007和SPSS 19.0软件对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 农用硫酸链霉素对烟草青枯病拮抗菌抑菌活性影响

表1 农用硫酸链霉素与拮抗菌混合液对烟草青枯病菌生长的影响

由表1可知，农用硫酸链霉素与拮抗菌发酵液混合液均对烟草青枯病病菌丝生长有一定抑制作用。当V农用硫酸链霉素∶V拮抗菌发酵液=3∶2时在第7天对青枯病菌丝生长抑制效果最明显。且随农用硫酸链霉素含量的度降低抑制率降低，在1∶4、0∶5比例下差异水平显著。

2.2 盆栽试验测定农用硫酸链霉素与拮抗菌AKJK-2013-02联合抑菌活性

表3 农用硫酸链霉素与拮抗菌混合液对烟草青枯病的盆栽防治效果

由表3可知，接种烟草青枯病的罹病烟株，在农用硫酸链霉素与拮抗菌发酵液混合液的共同作用下烟株发病率、病情指数均低于只加入拮抗菌发酵液的处理组(V农用硫酸链霉素∶V拮抗菌发酵液=0∶5)。在烟株灌根处理20 d后，配比为3∶2时烟株发病率最低为25.03%，病情指数为17.49%。

3 结论与讨论

通过农用硫酸链霉素与拮抗菌发酵液不同量配比下青枯病菌生长状况的研究发现：本研究各项比例混合液均对青枯病菌有抑制作用，且抑制效果较明显。在培养基中培养7 d后发现：当农用硫酸链霉素与拮抗菌发酵液混合比例为3∶2时，抑菌率达到84.7%，抑菌效果显著。

盆栽试验表明农用硫酸链霉素与拮抗菌发酵液混合液对于发病烟株有较好防效，烟株病情指数和发病率都明显低于对照(CK)。因此，抗菌素对烟草青枯病拮抗菌发酵液活性有较积极影响，能增加拮抗菌对青枯病的防效作用。

除抗菌素与生防菌结合共同防控研究外，今后还需加强农用抗生素与化学药剂、生物肥料，生防菌等进行优化复配试验，为拮抗菌充分利用提高科学依据。