Fsp27 基因沉默载体的构建及其对细胞脂解的影响研究

许祥 董维鹏 张少华 冯晨毅 刘田福 燕炯

（1. 山西医科大学公共卫生学院，太原 030001；2. 山西医科大学动物实验中心，太原 030001）

脂质代谢紊乱会造成脂肪堆积，进而引发肥胖症、脂肪肝、糖尿病等一系列代谢性疾病［1-2］。在哺乳动物体内，异常或过量的脂肪会在脂肪细胞中累积，形成脂滴（Lipid droplets，LD）。脂滴是一个与脂质储存、代谢和分泌密切相关的细胞器，由甘油三酯（Triglyceride，TG）、胆固醇酯的中性脂肪核心及单层磷脂包被组成［3］。Fsp27 是一种脂滴表面结合蛋白，是调控脂滴发育和脂质沉积的关键因子［4］。Fsp27 蛋白定位于脂滴表面，并富集在脂滴与脂滴的接触位点（Lipid droplet contact site，LDCS），调节脂滴代谢，介导脂滴之间的相互融合形成单个大脂滴［5-6］，但其具体的作用机制尚不明确。

本研究以分化的3T3-L1［7］脂肪细胞作为研究模型，通过构建shRNA 基因沉默载体沉默Fsp27基因，探究Fsp27基因沉默对脂肪细胞脂解的影响，以及对脂滴的形成、融合过程中的作用，推断其具体机制，旨在为了解Fsp27基因的生物学功能、脂类代谢疾病的治疗和预防奠定重要的实验基础和提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

3T3-L1 前脂肪细胞系、DMEM 高糖细胞培养基、BCA 蛋白定量试剂盒、β-Actin 抗体、山羊抗兔Ig G 抗体、山羊抗鼠Ig G 抗体（武汉BOSTER 生物工程公司），3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）、地塞米松（DEX）、胰岛素（Ins）、Lipofectamine 3000、P3000TM试剂、油红O 染料（Sigma 公司，美国），真核表达载体（编号：GV104）（上海吉凯基因化学技术有限公司），离心柱型质粒小提试剂盒（北京天根生化科技有限公司），甘油三酯检测试剂盒、甘油含量检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），HSL抗体、ATGL 抗体、Fsp27 抗体（Abcam 公司，英国），PPARγ 抗体（Bioworld 公司，美国），GAPDH（CST公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 sh-Fsp27 干扰载体的构建 查找NCBI 基因数据库中小鼠Fsp27基因mRNA（NM_001301295）碱基序列，设计3 条与小鼠Fsp27基因序列一致，且与其它基因同源性最低的阳性序列，同时再设计1 条与小鼠Fsp27基因无任何同源性的阴性对照序列（表1）。设计好的4 个靶点序列委托上海吉凯基因化学技术有限公司合成。构建带有RFP 红色荧光的真核表达质粒载体GV104，鉴定其DNA 序列。3 条阳性重组干扰载体分别命名为sh-Fsp27-1、sh-Fsp27-2、sh-Fsp27-3，阴性对照为sh-Fsp27-0。

表1 小鼠sh-Fsp27 重组载体干扰靶点

1.2.2 质粒的扩增（工具菌培养）与提取 取适量菌液均匀涂布在含有氨苄青霉素的LB 固体培养基平板上，37℃恒温倒置培养，待培养平板上长出单个菌落后，挑取菌落接种于含有氨苄青霉素（终浓度为50 μg/mL）的LB 液体培养基中。将接种好的锥形瓶置于37℃恒温摇床中220 r/min，振荡培养16 h。采用碱裂解法，严格按天根质粒小提试剂盒说明书在无菌环境中提取质粒。通过微孔板分光光度计测定质粒的浓度和纯度（A260/A280值），剩余质粒放于-20℃保存备用。

1.2.3 细胞培养与诱导分化 用含10%FBS 的DMEM 高糖培养基培养3T3-L1 前脂肪细胞：将其放置于环境为37℃、5% CO2的恒温培养箱中培养，2 d 更换完全培养液1 次。将细胞接种于6 孔板中，待细胞汇合至80%左右时，按本课题组前期优化过的经典“鸡尾酒”方法，诱导分化3T3-L1 前脂肪细胞成为成熟的脂肪细胞。对照组诱导分化后用完全培养基继续培养，2 d 换液1 次，sh-Fsp27-0 组（即阴性对 照组）、sh-Fsp27-1 组、sh-Fsp27-2 组、sh-Fsp27-3 组在诱导分化4 d 时进行脂质体转染。

1.2.4 脂质体转染 sh-Fsp27-0 组、sh-Fsp27-1 组、sh-Fsp27-2 组、sh-Fsp27-3 组细胞在诱导分化4 d 时，取出六孔板，按照Lipofectamine 3000 转染试剂说明书进行转染，37℃孵育细胞2 d，然后荧光显微镜观察转染效果。

1.2.5 油红O 染色 在细胞干预完成后，弃掉六孔板中培养基，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛缓冲溶液，室温固定细胞1 h。用PBS 洗净残留的多聚甲醛缓冲溶液，每孔加入油红O 工作液1 mL（现配现用）。室温染色1 h 后蒸馏水清洗残留油红O 工作液，置于显微镜下观察并拍照。

1.2.6 TG 含量与甘油含量检测 细胞干预完成后，收集6 孔板中的细胞至EP 管。每个EP 管中加入900 μL PBS 缓冲液，用枪头吹打细胞沉淀至细胞悬浮。在冰水浴条件下进行超声破碎细胞。制备好的匀浆液直接按照甘油三酯（TG）试剂盒检测说明书测定TG 含量，每组以细胞总蛋白浓度对测定值进行校正。制备好的匀浆液70℃金属浴10 min，灭活脂肪水解酶，严格按照甘油测定试剂盒说明测定样本甘油含量。根据预先绘制的标准曲线计算各样本的甘油含量，并以每mg 蛋白浓度对测定值进行校正。

1.2.7 Western-blot 检测细胞中Fsp27、HSL、ATGL和PPARγ 蛋白表达 收集各组细胞沉淀至EP 管中，加入200 μL 细胞总蛋白裂解液，冰上裂解10 min，4℃、12000 r/min 离心15 min，取上层液体即为待测总蛋白样品。采用BCA 法测定各组待测样品的总蛋白浓度，并调平浓度。PAGE 电泳，电泳参数：浓缩胶80 V 恒压，分离胶120 V 恒压；湿式转膜，参数：220 mA 恒定电流，转膜持续2 h。取出NC 膜，浸入封闭液中封闭2 h。蛋白一抗4℃过夜孵育。次日，取出条带，孵育二抗，37℃摇床2 h。显影仪曝光目的条带，挑选出目的条带清晰、背景浅的图片。用ImageJ 软件对目的蛋白条带进行分析并测定吸光度值，以β-actin 进行校正。

1.2.8 统计学分析 采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析。实验数据统一采用x-±s来描述。计量资料采用t检验进行分析，多组样本均数比较采用one-way ANOVA 进行分析。

2 结果

2.1 干扰载体的鉴定

通过0.8%琼脂糖凝胶电泳，4 组质粒电泳条带均位于6500 bp 附近（图1-A），提取的质粒准确，可进行后续实验。经过DNA 测序结果证实，3 个sh-Fsp27 阳性干扰载体中的插入的shRNA 编码序列正确，与预期设计合成的干扰序列相符合（图1-B）。

2.2 质粒浓度、纯度

经DH5α 大肠杆菌培养后提取质粒，质粒浓度为300-700 μg/mL，A260/A280均介于1.8-2.0 之间，可用于脂质体转染（表2）。

图1 sh-Fsp27 质粒序列鉴定

表2 质粒浓度和纯度鉴定（±s）

表2 质粒浓度和纯度鉴定（±s）

Vector A260/A280 Concentration/（μg·μL-1）sh-Fsp27-0 1.87±0.03 430±7.8 sh-Fsp27-1 1.83±0.15 356±5.2 sh-Fsp27-2 1.90±0.07 468±8.2 sh-Fsp27-3 1.94±0.15 536±10

2.3 细胞转染效果及Fsp27蛋白的沉默效果

细胞脂质体转染4 d 后，荧光显微镜下观察拍照显示：4 组红色荧光蛋白基本表达一致，转染效率在45%左右（图2-A），阴性对照组和阳性sh-Fsp27 干扰载体之间的转染效果没有显着差异。Western blot 结果显示，与sh-Fsp27-0 组和空白组比较，3 个阳性干扰载体可以明显下调Fsp27 蛋白的表达量（P＜0.05）（图2-B），且在3 个阳性载体中sh-Fsp27-2 干扰载体下调Fsp27 蛋白表达的效果最好，后续实验以sh-Fsp27-2 作为阳性组。

图2 Fsp27 基因沉默效果

2.4 脂肪细胞中脂滴的变化

未分化的3T3-L1 前脂肪细胞呈纤维样，胞质内无明显脂滴。诱导分化后，细胞形态由成纤维样变为圆形，伴随着胞体的增大，胞内出现脂滴。油红O 将细胞中的脂质染成红色，普通光学显微镜下观察可见，对照组与sh-Fsp27-0 组脂滴生成较快，8 d时能明显观察到脂滴聚集，12 d 可见小脂滴融合成大脂滴；阳性sh-Fsp27 组均可见大量小脂滴广泛地分布于细胞核周围，且在12 d 时仍未出现明显的大脂滴（图3）。

图3 脂滴油红O 染色

2.5 脂肪细胞内TG和甘油含量

采用酶学方法检测3T3-L1 脂肪细胞内的TG 和甘油含量。与对照组和sh-Fsp27-0 组相比，阳性sh-Fsp27 组中TG 含量明显下降，甘油含量明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）（表3）。

2.6 脂肪细胞中MAPK信号通路及脂肪水解酶的表达

经Western blot 检测显示（图4），与空白对照组和阴性对照组相比，阳性sh-Fsp27 组PPARγ 蛋白表达量显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；阳性sh-Fsp27 组ATGL 蛋白表达量显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；各组之间HSL 蛋白表达量无显著差异（P＞0.05）。

表3 各组的TG 和甘油含量

3 讨论

图4 各组蛋白表达情况

脂肪组织是集体贮存和提供能量的主要组织，当脂质代谢紊乱时就会引发肥胖症、脂肪肝、高脂蛋白血症等疾病，严重危害人们的健康［8-9］。脂滴是脂肪组织的主要贮存场所，其表面存在众多的脂滴相关蛋白，在脂肪的代谢、转运和信号转导等方面发挥作用［10］。Fsp27 是新近才发现的一种脂滴相关蛋白，研究发现Fsp27 在促进脂滴融合，形成单房大脂滴，调控甘油三酯贮存方面具有重要作用，但其具体的作用机制尚不明确［11］。

Fsp27 蛋白表达于脂肪细胞中，当两个小脂滴相互接触时，Fsp27 在脂滴之间的接触点富集，小脂滴中的中性脂质定性转移到大的脂滴中，导致小脂滴的相互融合形成大脂滴［12］。本实验使用RNAi技术，成功构建了3 条Fsp27 基因沉默载体，并且证明了sh-Fsp27-2 组载体的效率最高，可用于后续实验。成功沉默了Fsp27基因，可以明显观察到脂肪细胞内大脂滴数量减少，小脂滴广泛分布，说明Fsp27基因表达量的减少可以抑制小脂滴的融合，使其呈“戒环样”结构包围着细胞核，从而减少了大脂滴的生成，结果与之前的报道一致［7，13］。在脂肪分解的过程中，细胞内甘油三酯水解主要是通过激素敏感脂肪酶（Hormone-sensitive lipase，HSL）和甘油三酯脂肪酶（Adipose triglyceride lipase，ATGL）两种关键脂肪水解酶来完成的。本实验中可以明显观察到阳性实验组中TG 含量减少，而甘油含量增加，说明通过下调Fsp27 基因的表达可以促进甘油三酯的水解。Fsp27 可以激活ATGL 的抑制因子早期生长反应蛋白1（Early growth response protein 1，Egr1），从而抑制ATGL 的转录水平［14-15］。本次实验在降低脂肪细胞中Fsp27 的表达后，可以观察到ATGL 表达升高，而ATGL 表达量的增加，进一步促进了脂肪的水解。

过氧化物酶体增殖物激活受体γ（Peroxisome proliferators-activated receptors-γ，PPARγ）是调节脂肪形成和能量代谢的关键因子，丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路的下游靶点，其作为核转录因子可调控Fsp27 的表达，促进脂肪细胞的分化和脂质沉积［16-17］。在沉默Fsp27基因后，Fsp27 蛋白的表达减少，从而负反馈调节使PPARγ 的表达升高（图5）。PPARγ 表达的升高也从侧面印证了Fsp27基因通过PPARγ 通路促进脂肪的生成，对脂肪细胞中甘油三酯的蓄积起正调控的作用。

图5 Fsp27 与MAPK/PPARγ 信号通路

4 结论

综上所述，sh-Fsp27-2 组基因沉默载体的效率最高，沉默Fsp27基因可以促进3T3-L1 前脂肪细胞的脂解。推测其作用机制可能是：Fsp27基因表达的缺失抑制了小脂滴的相互融合，增大了脂肪酶的接触面积，减少了对ATGL 转录的抑制，增强了ATGL介导的脂肪水解作用，从而促进了3T3-L1 前脂肪细胞的脂解。Fsp27基因通过PPARγ 通路促进脂肪的生成，对脂肪细胞中甘油三酯的蓄积起正调控的作用。