C 类花器官特征基因AGAMOUS（AG）调控植物花分生组织维持与终止研究进展

位明明 曾霞 安泽伟 胡彦师 黄肖 李维国

（中国热带农业科学院橡胶研究所 国家橡胶树育种中心 农业部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室，海口 571101）

花器官发育是指植物花原基发育为成熟的花器官过程，即花原基发育成花萼、花瓣、雄蕊和心皮等4 轮结构的过程，该过程是一个多阶段的发育过程，起始于花分生组织的启动，接着是花分生组织特征的决定和维持、花原基形成、花器官特征识别，以及花分生组织干细胞活性终止和花器官成熟。花发育作为高等植物世代交替中最引人注目的生理过程，一直以来都是植物遗传学研究领域跟踪的热点之一。了解植物成花调控过程，可以人为控制植物开花时间，加快选育种进程。

关于植物花器官发育理论最经典的莫过于Coen 等［1］提出的花器官发育“ABC”模型，以及Theissen 等［2］进一步完善提出的花器官发育“ABCDE”模型。植物花器官发育“ABCDE”模型认为花原基发育成具有四轮结构的花器官过程是由A、B、C、D 和E 这5 类花器官特征基因控制，其中A 类基因控制萼片和花瓣的发育；B 类基因控制雄蕊和花瓣的发育；C 类基因控制心皮和雄蕊的发育；D 类基因控制胚珠的发育；E 类基因与其他4类基因协同调节花器官发育过程，参与所有花器官结构的形成。

进一步研究发现在植物花器官发育5 类特征基因中，除A 类基因中的AP2 以外，其余花器官特性基因几乎都属于MADS-box基因家族［3］。鉴于被子植物在进化过程中DNA 片段或全基因组重复已独立发生了多次，且不同物种中MADS-box基因的拷贝数存在较大差异，导致许多平行同源基因发生了亚功能化［4］。因此，MADS-box基因家族最显著的特征是在不同植物花发育过程中其家族成员之间的作用差异较大。前人通过对不同物种中MADS-box基因家族的功能进行比较分析发现，在不同植物开花时间控制、花分生组织维持、花器官决定、轮裂区形成、果实成熟、胚胎发育及营养器官发育等方面MADS-box基因家族成员具有不同的调控功能［5-7］。如MIKCc型MADS-box基因家族成 员SOC1（SUPPRESSOR OF OVERESPRESSION OF CONSTANS1）、FLC1（FLOWERING LOCUS C）、AGL24（AGAMOUS-LIKE GENE 24）、MAF1/FLM（MADS AFFECTING FLOWERING） 及SVP（SHORT VEGETATIVE PHASE）基因在植物开花调控中起重要作用［8-10］；AP1（APETALA 1）、FUL（FRUITFUL）及CAL（CAULIFLOWER）基因在花分生组织决定 中 起 重 要 调 控 功 能［11］；SEP1-3（SEPALLATA 1-3）、AP3（APETALA 3） 及PI（PISTILLATA） 基因在花器官形成中具有重要调控作用［12］；TT16（TRANSPARENT TESTA16）基因在种子色素沉积与胚胎发育方面具有重要调节作用［13-14］。总之，在植物花发育及生殖发育过程中不同MADS-box基因家族之间通过相互作用，从而构成一个复杂的基因表达调控网络来系统调控从花原基分化到花器官形成的整个生殖发育过程。

在调控植物花器官发育的5 类特征基因中，近年来诸多研究表明C 类功能基因AGAMOUS（AG）在花器官发育中扮演着重要的角色，它们在植物花发育和干细胞维持及终止发育过程的基因调控网络中具有核心功能。本文综述了近年来AG 基因在植物花发育中的核心功能、AG基因与其他遗传因子相互作用的反馈调节途径、尤其是AG 基因家族、表观遗传因子（MicroRNAs，miRNAs），以及其他调控因子之间相互作用调控花器官分化的基因调控网络的结构和功能，旨在为进一步认识植物花发育及干细胞调控提供文献依据。

1 植物花分生组织的维持和终止调控

一般来说植物花发育过程可分为开花决定、花的发端和花器官发育3 个阶段。开花决定作为植物营养生长向生殖发育转变的起始过程，首先要经历顶端花芽向花序分生组织的转变，接着由花分生组织分化出花器官。花器官作为被子植物特有的生殖器官，由4 种不同类型的花器官构成，即萼片、花瓣、雄蕊和心皮，这些花器官由花分生组织发育而来，而每一个花分生组织的中心区域都含有少数多能干细胞和未分化的干细胞［15］。

在开花决定阶段，花分生组织在其侧面的外周区域产生花原基，通过调节花原基中干细胞的数量和位置来确保花分生组织的稳定性，并允许干细胞在花器官发生前不断积累［16］。为形成适当数目的花器官，花分生组织不仅要维持一定的干细胞活性，其干细胞增殖率还必须与花器官形成率相协调［17］，即花分生组织在发育过程中表现一定的动态平衡。花分生组织的这种动态平衡是由花分生组织终止调控程序所决定。如果花分生组织终止过早，干细胞就无法产生准确数目的花器官；相反，延迟或无花分生组织终止调控过程会导致植物生殖器官的衰竭和雄性不育［18］。因此，花分生组织终止调控对于下一代的物质分配至关重要。

然而，与茎尖分生组织发育过程存在明显不同的是，花分生组织在细胞增殖与花器官起始过程中不仅表现出一个动态平衡，而且在花器官发育的某一特定阶段，花分生组织的遗传调控程序还必须被终止［19-20］，随后花分生组织才能形成4 类不同的花器官。因此，在花发育及生殖发育过程中，花分生组织发育过程是被限定的，一旦花分生组织产生了所有的花器官原基，它就会在心皮发育过程中被消耗掉，干细胞活性就此终止［21］，这一精确的终止过程使得花分生组织形成诸如雌蕊的生殖器官［22-23］。如在双子叶植物花器官发育的第6 阶段，当不同雌蕊群沿花序轴内外侧及近花序轴生长，导致花序轴中央凹陷区形成时，花分生组织的发育终止必须完成［24］。总之，在开花决定阶段，花分生组织必须经历平衡与拮抗这2 种连续发生的调节过程：即生殖细胞的自我更新以维持其增殖活性；花分生组织的维持和终止，以及对外周细胞的招募以形成花器官［25-26］。成功的花分生组织决定能够确保植物正常的生殖发育和生命周期进程。因此，花分生组织的维持和终止在植物器官发生和世代交替中起着至关重要的作用。

2 C 类花器官特征基因AGAMOUS（AG）调控植物花发育研究进展

2.1 C类花器官特征基因AGAMOUS（AG）的结构、种类及表达特征

AG 基因属于MADs-box 基因家族，其编码的转录因子属于一类 MADS 结构域家族蛋白，该基因序列从 5′端到 3′端依次可分为5 个区域：N 末端、M 区（编码约57 个氨基酸的MADS-box 区）、I 区（Intervening region）、K 区及C 末端［27］，其中M 区高度保守，其编码的MADS 蛋白结构域可以结合靶DNA；I 区和K 区相对保守，能够调节蛋白质与蛋白质间的相互作用，是转录因子的结构特征序列；C末端则特异性较强，具有2 个相对保守的AG Ⅰ区和AG Ⅱ区［28］，是AG基因的标志性序列。

AG基因编码的氨基酸序列属于植物特有的MIKC 型C 类MADS-box基 因［29］。 在 花 器 官发育ABC 模型中，C 类功能基因可以分为AG 和PLE 两个亚家族［30］。如在拟南芥基因组中，AG、SHATTERPROOF1（SHP1）、SHATTERPROOF2（SHP2）和SEEDSTICK（STK）4个基因属于AG亚家族，其中SHP1和SHP2以前也被称作AGAMOUS-LIKE 1（即AGL1）和AGAMOUS-LIKE 5（即AGL5），SKT 以前则被称为AGAMOUS-LIKE 11（即AGL11）。系统发育学分析表明SHP1，SHP2和STK属于AG进化系［31］，推测在数亿年的进化过程中，AG 基因可能由于环境或其他偶然因素的改变导致其产生新的拷贝，使得AG 基因在后续的演化过程中产生功能分化，从而形成两个具有特异功能的亚家族来共同承担原C 类功能基因的功能。

目前已在诸多物种中克隆到AG同源基因。对不同物种中AG同源基因的时空表达模式和功能进行分析，结果显示AG 同源基因的表达模式不仅具有一定的组织特异性，且功能相近。如OsMADS3和OsMADS58 作为水稻基因组中AG 同源基因的代表，两者主要在花分生组织中特异表达，参与了水稻花分生组织决定过程［32］；RhAG 作为玫瑰中AG同源基因的代表，在雄蕊发育中显著高调表达，沉默玫瑰中AG的同源物RhAG 可以导致其花瓣数量增加［33］，表明RhAG 与拟南芥中AG 的同源物一样，主要参与雄蕊发育；杨树中AG和STK基因的功能相对保守，沉默AG 和STK 的同源基因会改变其花器官特性，进而影响到杨树花器官确定性、胚珠分化和种毛发育［34］。总之，尽管AG基因在裸子植物和被子植物分化之前就已出现，然而序列分析和基因表达特征表明，这些同源基因在序列特征上虽有一定差异，但功能相近，表明在数亿年的进化过程中AG同源基因的功能相对保守。

2.2 C类花器官特征基因AG调控花分生组织维持及终止发育过程

在调控植物花发育过程的众多MADS-box基因家族之间，诸多研究证实C 类花器官特征基因AGAMOUS（AG）在花分生组织干细胞活性的维持及终止调控中具有重要调控功能［35-36］。目前，在模式植物拟南芥中部分调控花分生组织发育终止的转录因子已被初步鉴定出来。前人研究发现植物C 类花器官特征基因AG 编码的MADS 转录因子家族成员，在花分生组织发育的终止调控过程中，以及雄蕊与雌蕊的花器官决定中起着核心调控作用［37-38］。在花器官发育第6 阶段，AG基因通过抑制分生组织维持关键基因WUSCHEL（WUS）的表达，以时空特异的方式关闭花序分生组织细胞维持程序。在早期花序分生组织发育过程中（花器官发育第3 阶段）WUS基因的表达能够激活AG基因的表达。当WUS基因的表达量开始下降时，AG基因处于活化状态［39-40］。如在ag基因突变体植株中，WUS基因在花器官发育第6 阶段后仍处于活跃表达状态，而WUS基因的高调表达能够诱导花分生组织发育过程产生不确定性，使得ag基因突变体植株在第4 轮花器官形成后其花序分生组织发育过程不被终止，花发育过程表现出不确定性，导致突变体植株的花器官出现一个只含萼片和花瓣，以及数量不确定的轮轴，产生“花嵌花”的表型［41-42］。

进一步研究发现AG基因在时空上抑制WUS基因的表达是由2 条不同的基因调控通路所控制，其一AG基因通过招募PCG 蛋白（Polycomb Group protein，PCG）对WUS基因位点进行必要的组蛋白H3K27 甲基化修饰；其二AG 基因在时空上抑制WUS基因的表达过程部分是通过对C2H2 锌指蛋白KNUCKLES（KNU）基因的激活来实现［43］。如在knu突变体中，WUS基因在花器官发育第6 阶段之后的雌蕊中仍然呈现出持续高调表达趋势［44］。总之，前人研究表明AG基因能直接激活KNU基因的表达，该过程需要PcG 复合体的驱逐效应，导致细胞周期依赖的KNU基因诱导感应［45］，而对KNU基因激活的精确控制则有助于确定花分生组织终止的时间。

2.3 C类花器官特征基因AG与生长素协同调控花序分生组织终止与雌蕊形成过程

花分生组织终止及雌蕊形成过程中生长素动态平衡同样起着至关重要的作用［46］。然而，与生长素动态平衡相关的基因通常在植物生长发育的各个阶段都表达，这就要求在花器官发育过程中生长素的动态平衡必须以组织特异性或阶段特异性的方式被精细调整。前人研究表明生长素的动态平衡有助于产生对于生长发育具有重要作用的生长素极大值。不仅已知的生长素载体PIN-FORMED 家族能够影响生长素的极大值，而且其他一些跨膜蛋白也能够影响生长素的极大值［47］。如TORNADO2（TRN2）基因编码一个跨膜蛋白，该基因通常在柱头中高调表达，导致柱头中出现生长素极大值；而在trn2 功能缺失突变体中生长素的极大值却出现在叶片中［48］，表现十分异常。

为了弄清AG基因与生长素动态平衡在花分生组织终止中的协同作用关系，前人对AG基因下游不依赖于KUN基因的花分生组织终止调控通路进行深入探究，揭示出一个花器官特征因子AG 与生长素动态平衡相关基因之间协同调控花分生组织终止与雌蕊发育的分子调控通路［49］。如在拟南芥花分生组织终止调控过程中，AG基因能够直接激活其下游靶基因CRABS CLAW（CRC）的表达，而CRC基因能通过抑制TRN2基因的表达，在随后的雌蕊形成过程中产生适当的生长素极大值，用以降低花分生组织活性，从而实现对花分生组织终止过程的精细调控。

进一步对AG基因下游靶基因CRC与KNU基因的功能进行深入分析，结果表明CRC与KNU基因的突变都能扰乱植物花分生组织发育的确定性。如前人对crc与knu基因的双突变体植株表型进行鉴定，结果发现在crc与knu基因的双突变体植株中花分生组织发育过程表现出强烈的不确定性［50］，而crc基因突变体植株的部分表型能被生长素运输抑制剂所恢复［47］，表明CRC与KNU这2 个关键基因在花分生组织终止及雌蕊发育中具有重要调控功能。此外，在其他多种被子植物crc 同源基因突变体植株中，花序分生组织的发育过程同样都表现出强烈的不确定性［51］，表明在植物进化过程中CRC基因可能具有保守的、普遍存在的功能。

总之，前人研究证实花器官特征因子AG及其靶基因CRC与KNU能够协同调控植物花分生组织的终止过程。在该过程中AG基因的2 个靶基因CRC与KUN能够协同调控并抑制WUS 基因的表达，而CRC基因则能通过抑制TRN2基因的表达来控制花分生组织的确定性。因此，AG-WUS 与AG-KUNWUS 调控通路可能在确定花分生组织的终止时间方面起着核心作用［52］。进一步研究发现由这两个非同源基因触发的协同效应被认为是由多个或不同的调控通路中断引起的［53］。

2.4 C类花器官特征基因AGAMOUS（AG）与表观遗传因子协同调控花分生组织终止与雌蕊形成过程

开花决定和干细胞活性，以及花分生组织的维持和终止过程亦受到不同类型的花器官同源蛋白基因及表观遗传因子之间的协同调控。在开花决定、花分生组织维持及终止调控过程中染色质重塑因子可以通过与特定目标基因的关联和结合，实现花器官特征基因的时空特异性表达。前人研究发现动植物中普遍存在的多梳蛋白抑制复合物PRC2（Polycomb Repressive Complex 2，PRC2）能通过介导染色体H3K27 三甲基化（H3K27me3）形成异染色质，从而抑制基因表达，在基因的组织特异性表达中起关键作用［54］。PRC2、CURLY LEAF（CLF）、及Swinger（SWN）基因作为植物中已知的主要甲基转移酶［55］，能够催化染色体的H3K27me3 水平，且PRC2 留下的抑制性H3K27me3 标记能被PRC1 识别，后者可以单泛素化组蛋白H2A［56］，从而抑制基因表达。

前人研究证实AG基因的组织特异性表达亦受到CLF基因的抑制，CLF 可能形成一种类似于PRC2 的复合物（CLF-PRC2）来抑制AG基因在营养器官中的表达。与此观点一致的是，在拟南芥整个叶片发育过程中AG基因座都携带弥散的H3K27me3位点［57］。在AG 基因组织特异性表达过程中，一方面PRC2 可能直接或间接地作用于基因组位点；另一方面PRC2 可能通过与其他DNA 结合蛋白的相互作用来识别靶基因位点，如AG 基因可以与WUS 基因位点的CArG 盒相结合，从而招募PRC2 和AS1-AS2 异二聚体来促进PRC2 与BP 和KNAT2基因的结合［58］。进一步对AG基因组织特异性表达所需的DNA 序列进行分析，结果显示AG基因本身的启动子不足以赋予其组织特异性，需要其内含子2 中的增强子序列来抑制AG基因在拟南芥幼苗期表达，该基因的内含子2 序列能够编码若干长链非编码RNA（lncRNA），表明AG基因的表达亦受到长链非编码RNA（lncRNA）的调控［59］。

目前，植物体内发现的LncRNAs 可分为3大类：长基因间的非编码RNA（LincRNA）、内含子非编码RNA（incRNA）和天然反义转录物（NATS）［60］。前人通过对AG 基因内含子2 的序列特征进行分析，从中鉴定出4 个incRNAs，并提供证据表明AG-incRNA4 可能与CLF基因相互作用，与CLF 基因一起共同担当抑制因子的作用，从而招募CLF-PRC2 复合物来抑制AG基因的表达［61］。此外，AG-incRNA4 还能招募PRC2 到AG-incRNA4 的启动子区域来下调AG基因自身的表达。相反，CLF或AG-incRNA4 的缺失会导致AG 基因的去阻遏和H3K27me3 标记的减少，表明与CLF 相关的AGincRNA4 是AG 基因活性抑制所必需的［62］。同样，在其他花器官特征基因的抑制表达过程中也存在类似的机制，非编码RNA 可能有助于PRC2 结合其靶基因位点。如一个拟南芥incRNAs-COLDAIR 已经被证实在春化后能通过招募PRC2 基因来抑制FLC 基因的表达［63］。尽管目前关于AG基因内含子序列的作用机制仍然未知，但对于AG基因表达抑制机制的研究结果可能会对将来其他植物MADS-box基因的组织特异性表达研究有所启发，并提供有关真核生物中LncRNAs 作用机制的更多信息。

3 展望

花分生组织维持及终止对于下一代的资源分配至关重要，成功的花分生组织决定是确保植物生殖发育正常和生命周期进程的前提。以往对植物干细胞调控机制的研究主要集中在茎尖分生组织，该分生组织在植物整个生命周期都能维持其干细胞种群。相反，花分生组织在发育过程中不仅要经历干细胞命运的基因编程终止，而且这一过程还必须与其他花发育程序相协调，如花器官形成和果实发育。因此，同时，花分生组织对于理解干细胞的维持和终止，以及干细胞活动与其他发育过程之间的相互作用也提供了一个良好模型。从实际应用角度来看，由于花序干细胞终止与心皮原基的形成有关，调整花分生组织干细胞终止时间可能会影响果实大小［64］。

然而，目前对于C 类花器官特征因子AG 与其他遗传因子协同调控花分生组织维持及终止发育过程的分子机制研究尚处于起始阶段然。迄今，在生长素介导的花分生组织终止调控通路中仅鉴定出一个生长素感知相关转录因子ARF3，进一步研究发现ARF3 介导的生长素感知效应能够控制包括雌蕊形成在内的大量生长素相关事件［65］，在花分生组织终止调控过程中ARF3 能直接绑定到WUS基因的启动子近端区域来抑制其表达［66］，推测ARF3 可能在CRC-TRN2 调控通路的下游起作用。

尽管前人研究证实AG基因与生长素的局部功能在花分生组织终止及雌蕊形成过程中起着至关重要的作用，并揭示出一个花序分生组织终止相关的时空调控通路，但目前对于AG基因与生长素介导的花序分生组织终止及雌蕊形成的分子调控机理仍存在许多未知问题，如AG基因如何精确的改变花分生组织细胞种群的活性；生长素在花分生组织终止时可能发挥的功能仍不清楚；生长素抑制WUS基因表达导致下游调控通路中断，对于这些下游调控通路的功能尚未完全了解等［67］。

在AG基因参与调控花分生组织维持与终止的分子机制研究方面仍存在以下几个主要问题，如AG基因如何通过特定复合物以时间和空间特定方式进行调节；花发育过程中AG基因介导的多聚体复合物如何在特定位点组装；AG基因如何协调内在发育进程与外在环境因子之间的交叉对话，以及AG基因、激素信号因子和染色质因子如何以稳健与不同效应的方式协调和汇聚产生一个强大的遗传网络用于调控花分生组织维持与终止及雌蕊形成等花发育过程［68-69］。尽管诸多研究结果证实，拟南芥和番茄之间都存在保存的花分生组织终止机制，表明其他被子植物中也可能使用类似的过程来调控花分生组织终止［70］。然而，目前对于植物中AG基因的作用位点及调控模式依然模糊不清，进一步弄清AG基因介导的靶基因作用位点及调控模式将为控制植物花分生组织干细胞维持到雌蕊形成转变过程的转录级联调控提供新见解。随着技术的进步，借助于染色质免疫沉淀（chip）和高通量DNA 测序（chip-seq）技术将有助于识别花发育过程中受AG基因等主效转录因子绑定的基因组区域及位点。

此外，前人研究表明花器官决定和干细胞活性亦受到不同类型的花器官同源蛋白转录因子、激素合成基因、信号分子及表观遗传因子（调节下游元件）之间的协同调控。一种同源蛋白可以通过形成高阶复合物与上千个靶位点相结合。花器官同源蛋白基因、转录因子、激素和表观遗传因子可以聚集在一起调节多种常见下游基因的表达，从而执行复杂的发育过程。这些过程涉及花器官特征确定，花器官形成与分化，以及其他重要的花发育过程，包括花分生组织的维持和终止，花器官模式和边界形成，以及配子体发育。如AG基因的表达亦受到其他花器官特征因子LEAFY（LFY）、APETALA1（AP1）、以及APETALA2（AP2）基因的协同调控［71-73］。其他一些TFs，如SUPERMAN（SUP），CRABS CLAW（CRC），PERIANTHA（PAN）和ULTRAPETALA（ULT）也能在较小的程度上，以部分冗余的方式调节花分生组织的维持和终止［74-77］，对于它们之间如何通过相互作用来协同调控植物花器官分化及花分生组织维持和终止发育过程仍然未知，需要进一步深入探索其内在的分子调控机制。总之，进一步剖析AG基因控制花分生组织维持及终止发育过程的基因调控网络的结构和功能，将为植物花分生组织干细胞维持到雌蕊形成转变过程的转录级联调控提供新见解。