高效液相色谱法同时测定骨折挫伤胶囊中羟基红花黄色素A 和大黄素含量*

胡小祥，何 艳

（1. 郴州市食品药品检验检测中心，湖南 郴州 423000； 2. 湘南学院药学院，湖南 郴州 423000）

骨折挫伤胶囊由猪骨、炒黄瓜子、煅自然铜、红花、大黄、当归、醋乳香、醋没药、血竭、土鳖虫10 味药材组方，具有舒筋活络、接骨止痛的功效，主治跌打损伤、消肿散瘀、扭腰岔气等症[1]1188。现行质量标准收载于2015年版《中国药典（一部）》，含量测定项下仅以血竭素为指标成分来控制血竭的质量，未对处方中红花和大黄等药材进行质量控制。方中红花活血通经、散瘀止痛，主要成分为羟基红花色素A[1]151；大黄逐瘀通经、跌打损伤，主要成分为大黄素[1]23。目前，关于该制剂中羟基红花色素A 和大黄素的含量测定采用不同液相色谱法进行单独测定[2-3]，耗时费力。本研究中拟建立同时测定该制剂中羟基红花色素A 和大黄素含量的高效液相色谱（HPLC）法，为控制该制剂的质量提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260 型高效液相色谱仪，配置G1315D 型DAD 检测器（美国Agilent 公司）；AUW-220D 型电子天平（日本岛津公司，感量为0.01 mg）；KQ-300DE 型超声清洗器（昆山超声仪器有限公司）。

1.2 试药

骨折挫伤胶囊（厂家A，批号分别为180103，171001；厂家B，批号为20170602）；羟基红花黄色素A对照品（批号为111637-2013086，纯度为96.5%），大黄素对照品（批号为110756-201512，纯度为98.7%）均由中国食品药品检定研究院提供；甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters sunfire-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0 ～9 min 时15% A，9 ～10 min 时15%A→85% A，10 ～25 min 时85% A）；检测波长：403 nm（0 ～10 min），254 nm（10 ～25 min）；流速：1.0 mL/min，柱温：35 ℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液制备

供试品溶液：取骨折挫伤胶囊样品（批号分别为180103，171001，20170602）内容物适量，研细，取粉末约2 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，超声提取（300 W，40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，滤液过0.45 μm滤膜，即得。

混合对照品溶液：分别称取羟基红花黄色素A 和大黄素对照品适量，精密称定，用甲醇定容至刻度，制成质量浓度分别为42.54μg/mL 和40.80 μg/mL 的混合对照品贮备溶液。

阴性对照品溶液：取按处方工艺制备阴性样品，取适量，研细，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

图1 高效液相色谱图

2.3 方法学考察

系统适用性与专属性试验：分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。供试品溶液中羟基红花黄色素A 和大黄素色谱峰可达到较理想的分离效果，分离度大于1.5；且阴性对照品溶液在与对照品溶液色谱峰相应的保留时间无色谱峰出现，阴性对照无干扰，表明该方法专属性良好。色谱图见图1。

线性关系考察：分别精密吸取2.2 项下混合对照品溶液0.5，1.0，2.0，4.0，5.0，7.0 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，按2.1 项下色谱条件测定峰面积。以进样质量浓度为横坐标（X，μg/mL）、峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，得羟基红花黄色素A、大黄素回归方程分别为Y羟=28.014X-0.793（r=0.999 8），Y大=36.835X-0.342（r=0.999 8）。结果表明，羟基红花黄色素A、大黄素质量浓度分别在2.12 ～29.68 μg/mL，2.04 ～28.36 μg/mL 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取2.2 项下混合对照品溶液5 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，连续进样6 次。结果羟基红花黄色素A 和大黄素峰面积的RSD分别为0.77%和0.57%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密吸取同一批（批号为180103）供试品溶液10 μL，分别于0，4，8，12，16，24 h 时重复进样。结果羟基红花黄色素A 和大黄素峰面积的RSD分别为1.11%和1.36%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

重复性试验：取同一批（批号为180103）样品6 份，精密称定，按2.2 项下方法制备供试品溶液，精密吸取10 μL，按2.1 项下色谱条件测定峰面积。结果羟基红花黄色A 和大黄素平均含量分别为0.228mg/g 和0.108mg/g，RSD分别为1.67%和1.21% （n=6），表明方法重复性良好。

表1 加样回收试验结果（n=9）

加样回收试验：取已知含量的（批号180103）样品9份，约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，按样品中含羟基红花黄色素A 和大黄素的50%，100%，150%分别精密加入混合对照品溶液50 mL，按2.2 项下方法各平行制备3 份供试品溶液，进样10 μL，计算回收率。结果见表1。

2.4 样品含量测定

取不同厂家的样品适量，研细，取约2 g，精密称定，按2.2 项下方法制备供试品溶液，分别进样10 μL，测定峰面积，计算含量。结果羟基红花黄色素A 和大黄素的含量，厂家A（批号为180103）分别为0.228 mg/g 和0.108 mg/g，厂家A（批号为171001）分别为0.266 mg/g和0.110 mg/g，厂家B（批号为20170602）分别为0.159 mg/g 和0.051 mg/g（n=3）。

3 讨论

3.1 色谱条件选择

采用DAD 检测器，对羟基红花黄色素A 和大黄素混合对照品在200 ～800 nm 波长范围内进行全波长扫描，结果显示，羟基红花黄色素A 最大吸收波长为403 nm，大黄素最大吸收波长为254 nm。所用检测器具有波长切换功能，故本研究中选用403，254 nm 作为检测波长。参考文献[4-7]，比较了乙腈-0.5%乙酸溶液，乙腈-0.2%磷酸溶液，甲醇-0.5%乙酸溶液和甲醇-0.2%磷酸溶液作为流动相对供试品溶液进行分离。结果表明，采用甲醇-0.2%磷酸溶液为流动相，进行梯度洗脱时，羟基红花黄色素A 和大黄素分离效果好，分离度均大于1.5，且阴性对照无干扰。

3.2 提取条件选择

本研究中比较了甲醇、70%甲醇、乙醇和70%乙醇作为提取溶剂时的提取效果。采用乙醇和70%乙醇作为溶剂时，杂质较多，目标峰有干扰；采用甲醇、70%甲醇作为提取溶剂时，2 种有效成分在以甲醇为提取溶剂时得率最高，且测定无干扰，最终选择甲醇作为提取溶剂。同时还考察了加热回流提取和超声提取2 种提取方法的效果，结果显示，2 种提取方法对2 种有效成分提取的影响相似，但超声提取简单易行，故最终选择超声提取。以甲醇作为提取溶剂时，考察了超声提取10，20，30，40 min 对2 种有效成分提取的影响，超声提取30 min时，2 种有效成分基本提取完全，故选择超声提取30 min处理供试品。