止咳化痰合剂质量标准改进

徐丹洋，周 谧，张金星，王素素

（江苏省南通市食品药品监督检验中心，江苏 南通 226006）

止咳化痰合剂有清热、止咳、化痰功效，用于治疗各种疾病引起的咳嗽、痰难咳出及咳嗽痰多诸症。该合剂为黄棕色有少量沉淀液体，由陈皮、桔梗、浙贝、黄芩、连翘、前胡、紫菀等11 味中药饮片及1 味中药提取物组方，临床长期使用，效果较好，但一直缺少严格的质量控制方法。本研究中通过薄层色谱（TLC）法，对该合剂中桔梗、前胡、浙贝、紫菀4 味中药进行定性鉴别，通过高效液相色谱（HPLC）法对组方中陈皮、黄芩、连翘3 味中药进行含量测定，为该制剂的质量控制提供依据。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

U3000 型高效液相色谱仪（戴安仪器公司）；BT125D 型电子分析天平（赛多利斯公司）；HHS-11-6型恒温水浴锅（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）；Milli-Q 超纯水仪（Millipore 公司）。

1.2 试药

桔梗对照药材（批号为121028-201411）、贝母素甲对照品（批号为110750-201612）、贝母素乙对照品（批号为110751-201712）、白花前胡甲素对照品（批号为111711-201703）、紫菀酮对照品（批号为111581-201806）、橙皮苷对照品（批号为110721-201617）、黄芩苷对照品（批号为110715-201720）、连翘苷对照品（批号为110821-201615），均购自中国食品药品检定研究院；止咳化痰合剂由本地中医院提供；乙腈、磷酸均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别[1]

2.1.1 浙贝

取样品溶液30 mL，置分液漏斗中，加浓氨试液2 mL与三氯甲烷20 mL，振摇提取，取三氯甲烷层蒸干，残渣加三氯甲烷1 mL 使溶解，作为供试品溶液。取缺浙贝的阴性样品溶液30 mL，同法制成阴性对照品溶液。取贝母素甲对照品、贝母素乙对照品各适量，加三氯甲烷制成每1 mL 分别含上述成分2 mg 的混合对照品溶液。按2015 年版《中国药典（四部）》（通则0502）TLC 法（以下简称TLC 法）试验，吸取阴性对照品溶液、对照品溶液各10 μL，供试品溶液、供试品溶液-对照品溶液（1 ∶1，V/ V）各20 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液（17 ∶2 ∶1，V/ V/ V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性无干扰。详见图1 A。

图1 浙贝、桔梗、前胡薄层色谱图

2.1.2 桔梗

取样品30 mL，加7%硫酸乙醇10 mL，加热回流1 h，放冷，用三氯甲烷振摇提取2 次，每次30 mL，合并三氯甲烷液，加水洗涤2 次，每次30 mL，弃去洗液，三氯甲烷液用无水硫酸钠脱水，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，即得供试品溶液。取缺桔梗的样品溶液30 mL，同法制成阴性对照品溶液。另取桔梗对照药材1 g，加水50 mL，煎煮1 h，浓缩至30 mL，滤过，取滤液加7%硫酸乙醇10 mL，加热回流1 h，放冷，用三氯甲烷振摇提取2 次，每次30 mL，合并三氯甲烷液，加水洗涤2 次，每次30 mL，弃去洗液，三氯甲烷液用无水硫酸钠脱水，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，即得对照药材溶液。按TLC 法试验，吸取阴性对照品溶液、供试品溶液、对照药材溶液各10 μL，供试品溶液-对照品溶液（1 ∶1，V/V）20 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷-乙醚（2 ∶1，V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性无干扰。详见图1 B。

2.1.3 前胡

取样品30 mL，加石油醚（60 ～90 ℃）振摇提取2 次，每次30 mL，合并三氯甲烷液，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，即得供试品溶液。取缺前胡的阴性样品溶液30 mL，同法制成阴性对照品溶液。另取白花前胡甲素对照品，加甲醇制成质量浓度为0.5 mg/mL 的对照品溶液。按TLC 法试验，吸取阴性对照品溶液10 μL，供试品溶液、供试品溶液-对照品溶液（1 ∶1，V/V）各20 μL，对照品溶液5 mL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以石油醚（60 ～90 ℃）-二氯甲烷-乙酸乙酯（4 ∶2 ∶1，V/V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，在紫外灯（254 nm）下检视。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的荧光斑点，阴性无干扰。详见图1 C。

2.1.4 紫菀

取样品溶液30 mL，加乙酸乙酯萃取2 次，每次30 mL，合并滤液，蒸干，残渣加乙酸乙酯1 mL 使溶解，作为供试品溶液。取缺紫菀的阴性样品溶液30 mL，同法制成阴性对照品溶液。另取紫菀酮对照品，加乙酸乙酯制成每1 mL 含1 mg 的溶液，作为对照品溶液。按TLC 法试验，吸取上述阴性对照品溶液10 μL，供试品溶液、供试品溶液-对照品溶液（1 ∶1，V/V）各20 μL，对照品溶液5 mL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以石油醚（60 ～90 ℃）-乙酸乙酯（9 ∶1，V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，分别置日光和紫外光灯（365 nm）下检视。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上显相同颜色的斑点或荧光斑点，阴性无干扰。详见图2。

图2 紫菀薄层色谱图

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件[2]

色谱柱：Agilent-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0 ～10 min 时20%A，10 ～15 min 时20%A→25%A，15 ～20 min时25%A，20 ～25 min 时25%A→32%A，25 ～35 min 时32%A→37%A，35 ～40 min 时37%A→42%A，40 ～45 min时42%A→50%A，45 ～50 min 时50%A→90%A，50 ～55 min 时90%A，55 ～57 min 时90%A→20%A，57 ～65 min 时20%A）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：210 nm；进样量：10 μL。

2.2.2 溶液制备

取橙皮苷、黄芩苷、连翘苷对照品30.17，30.23，10.04 mg，精密称定，置同一100 mL 容量瓶中，加70%甲醇溶解并定容，摇匀，制成各成分质量浓度分别为0.290 0，0.283 0，0.095 3 mg/mL 的混合对照品贮备液；精密量取5 mL，置50 mL 容量瓶中，加70%甲醇定容，摇匀，经0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得混合对照品溶液。精密量取样品15 mL，置分液漏斗中，用水饱和正丁醇萃取3 次，每次30 mL，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水洗涤3 次，每次30 mL，取正丁醇层蒸干，用70%甲醇溶解转移至50 mL 容量瓶中，并定容，摇匀，经0.45 μm 微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。同法制备阴性对照品溶液[3-5]。

2.2.3 方法学考察

系统适用性试验：取2.2.2 项下混合对照品溶液、供试品溶液各适量，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图，见图3。理论板数按各待测成分峰计均大于3 000，分离度均大于1.5，基线分离良好。

专属性试验：取2.2.2 项下混合对照品溶液及阴性对照品溶液，按拟订色谱条件进样测定。结果在各待测成分峰处阴性对照无干扰，详见图3。

线性关系考察：取上述混合对照品贮备液1.0，2.5，5.0，10.0，50.0 mL，分别置50 mL 容量瓶中，加70%甲醇定容，摇匀，经0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得系列混合对照品溶液，分别依次注入高效液相色谱仪，进样量为10 μL，记录峰面积。以待测成分对照品质量浓度（X，μg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归。结果见表1。

表1 回归方程及线性范围（n=5）

精密度试验：取混合对照品溶液，按拟订色谱条件连续测定6 次。结果橙皮苷、黄芩苷、连翘苷峰面积的RSD分别为0.60%，1.02%，0.89%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取样品适量，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件，室温下分别于0，2，4，6，8，12，24 h 时进样测定。结果橙皮苷、黄芩苷、连翘苷峰面积的RSD分别为1.08%，1.12%，0.97%（n=7），表明供试品溶液室温下放置24 h 内稳定性良好。

重复性试验：取同一批适量样品5 份，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件测定。结果橙皮苷、黄芩苷、连翘苷峰面积的RSD分别为1.17%，1.29%，1.32%（n=5），表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密量取已知含量的样品，分别加入橙皮苷、黄芩苷、连翘苷质量浓度分别为0.301，0.325，0.065 0 mg / mL 的混合对照品溶液2.5，3.0，3.5 mL，依法制备供试品溶液，再按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算回收率。结果见表2。

2.2.4 样品含量测定

取样品适量，依法制备供试品溶液，并按拟订色谱条件进行测定含量。结果见表3。

图3 高效液相色谱图

表2 加样回收试验结果（n=9）

表3 样品含量测定结果（mg/mL，n=5）

3 讨论

合剂作为一种口服液体制剂，质量可控性较片剂、颗粒剂、胶囊剂等固体制剂差，且在运输，储存过程中易发霉、酸败，但其具有见效快、吸收好的特点，故很多中医院仍保留较多合剂类医院制剂[6]。止咳化痰合剂规定了性状、相对密度、pH、装量、微生物限度检查，但与大部分合剂标准一样只对外部特征进行控制，对能保证药品疗效的鉴别特征和指标性成分的控制较少。

本研究中通过TLC 法确定了组方中4 味中药的鉴别特征，斑点清晰、分离度好、专属性强。并建立了组方中3 味中药的含量测定方法，结果3 个待测成分分离度良好，阴性对照无干扰。本试验中对该方主要成分有了较严格的质量控制标准，保证了临床用药的安全性、有效性及合理性，对起到调和药性及处方中用量较少的其他4 味中药未设立质控标准。

预试验中，TLC 法条件参考2015 年版《中国药典》一部及四部，对提取溶剂、提取方法、展开剂、温湿度、薄层板、显色剂等均做系统考察，采用适合的溶剂提取待测成分可排除其他成分的干扰，选取合适的流动相配比可达到较好的分离效果，显色剂的选择可排除不同类型化学成分的干扰，最终优化出有显著鉴别特征的薄层色谱法，且比移（Rf）值在0.3 ～0.7 之间。

HPLC 法中，由于合剂中成分较复杂，故本试验中考察不同的提取方法：聚酰胺吸附柱色谱法（不同洗脱溶剂：乙醇、甲醇、70%乙醇、70%甲醇，不同洗脱体积：100，120，150，200 mL），正丁醇有效部位萃取法（考察水饱和正丁醇的萃取体积、萃取次数，正丁醇饱和水的洗涤体积、洗涤次数，正丁醇层蒸干后转移样品所用溶剂）等对待测成分的提取和纯化效果。由于聚酰胺洗脱慢，吸附较大（最高可达30%）[7]，以及不同品质的聚酰胺存在差异，导致试验结果重复性较差。同时文献表明，橙皮苷、黄芩苷、连翘苷在正丁醇中均有较好的溶解性[8-10]，故采用正丁醇萃取法来提取指标性成分。系统适用性试验中考察不同的流动相系统（0.1%磷酸溶液-乙腈，0.1% 磷酸溶液-甲醇）；考察不同品牌（Waters、Agilent、Shimadzu）的色谱柱，最终选定本研究中色谱条件，更好地保障了合剂的质量。