苦碟子对大鼠肾缺血再灌注损伤的预防作用*

胡厚军，郑 学，李 阳

（广东省深圳市人民医院，广东 深圳 518020）

肾缺血再灌注损伤（RIRI）是急性肾损伤的重要诱因，发生机制涉及氧自由基增多、炎性反应、免疫反应、细胞内钙超载、能量代谢障碍及某些激素代谢失调等[1]。研究证实，缺血预处理能减轻RIRI，而发生再灌注的最初几分钟是决定肾脏缺血最终预后的关键时间段，与缺血预处理相比，对再灌注前进行干预的缺血后处理，因其可操作性更强，具有更好的应用前景[1]。苦碟子注射液是由菊科植物抱茎苦荬菜全草中提取的有效活性物质制成的静脉用注射液，主要成分为腺嘌呤核苷、黄酮等，具有活血化瘀、抗血小板聚集、增强纤维蛋白酶活性、增强超氧化物歧化酶（SOD）活性和保护人脑微血管细胞的作用，可用于缺血性卒中、冠状动脉粥样硬化性心脏病（简称冠心病）、心绞痛的治疗[2-4]。研究表明，大鼠肾缺血再灌注模型术前预先腹腔注射苦碟子后能减轻RIRI，其机制与其抗氧化应激、减轻炎性损伤有关[5]，但术后再灌注前使用苦碟子是否也可通过抗氧化机制保护肾脏尚不清楚。本研究中建立大鼠RIRI 模型，旨在观察苦碟子对大鼠RIRI 的预防作用，并进一步探讨其作用机制，为临床防治RIRI 提供可行性措施。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物、仪器与试药

动物：健康雄性SD 大鼠30 只，普通级，10 周龄，体质量220 ～250 g，购自西南医科大学动物实验中心，许可证号SYXK（川）2018-213，实验动物质量合格证号0000422，动物实验设施合格证号0001797。标准饲料和水饲养，适应性喂养1 周。本实验经动物实验伦理委员会批准。

仪器：无创动脉夹（北京搏贝科技有限公司）；CX31型光学显微镜（日本Olympus 公司）；AU5800 型生化分析仪（美国Beckman 公司）；TG16 型离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；MK3 型酶标仪（美国Thermo Fisher 公司）。

试药：苦碟子注射液（通化华夏药业有限责任公司，国药准字Z20025450，规格为每支10 mL）；SOD 试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒（上海酶联生物科技有公司）；白细胞介素6（IL-6）定量分析酶联免疫吸附检测（ELISA）试剂盒、电化学发光（ECL）试剂盒（北京博凌科为生物科技有限公司）；兔抗大鼠核转录因子-κB（NF-κB）单克隆抗体（0.1 mL），山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG） -辣根过氧化物酶抗体（0.1 mL），（北京中杉金桥生物技术有限公司）；β-Actin（0.1 mL，美国Santa Cruz 公司）；3%戊巴比妥钠（北京拜尔迪生物技术有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分组、建模与给药

将30 只SD 大鼠分为假手术组（等体积0.9%氯化钠溶液）、模型组（等体积0.9%氯化钠溶液）和苦碟子组（4 mL/kg），各10 只。术前12 h 禁食，取仰卧位固定，常规备皮、消毒，腹腔内注射3%戊巴比妥钠以麻醉大鼠，开腹，沿腹部正中切口，暴露双侧肾动静脉并小心分离，以无创动脉夹同时夹闭双侧肾动脉45 min 后放开动脉夹恢复血流灌注，肾脏颜色由酱紫色变为暗红色表明RIRI 模型建立成功。假手术组大鼠开腹后分离双侧肾动脉，不进行夹闭，暴露45 min 后逐层缝合，关腹。恢复血流灌注前5 min 同一时刻，各组大鼠经尾静脉注射给予相应药物。

1.2.2 指标检测

病理组织学检查：于缺血再灌注24 h 后处死大鼠，以0.9%氯化钠溶液灌注肾脏后摘取，将摘取部分肾脏置10%甲醛中固定后行石蜡包埋、切片、苏木素-伊红（HE）染色，光学显微镜下观察染色后肾脏病理组织学变化[6]。

肾功能指标检测：于大鼠腹主动脉采血3 mL，置离心管中，3 000 r/min 离心20 min，取上清液，以生化分析仪检测大鼠血清肌酐（SCr）和尿素氮（BUN）水平[7]。

图1 大鼠肾组织形态学变化（HE，×400）

肾匀浆中IL-6 含量检测：采用ELISA 法检测。将摘取部分肾脏剪切成小块，磨碎后加入磷酸盐缓冲液（PBS）常规离心，弃上清液，加入Buffer A 和Buffer B 进行振荡，在4 ℃条件下，15 000 r/min 离心10 min，取上清液得细胞质蛋白，将Buffer C 加入沉淀物中，振荡，离心，取上清液得核蛋白。在反应板孔中加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体，封板膜盖住反应板37 ℃水浴60 min，揭开封板膜弃去液体，加洗涤液静置20 s，甩液拍干（重复4 次）；将底物液A 和B 按1 ∶1 体积混合后加入孔中；封板，在37 ℃条件下水浴15 min，在孔中加入终止液，以酶标仪检测并记录数据[8]。

肾匀浆SOD 活性和MDA 含量检测：将摘取的部分大鼠肾脏以研磨棒磨碎后称定质量，制成肾组织匀浆，取10%组织匀浆50 μL，在4 ℃条件下，15 000 r/min离心10 min，取上清液，检测SOD 活性和MDA 含量[9]。

NF-κB 蛋白表达检测：采用Western Blot 法检测。将上述部分肾组织匀浆转入离心管，加苯甲基磺酰氟冰浴裂解30 min，在4 ℃条件下，10 000 r/min 离心15 min，取上清液，以蛋白定量（BCA）法检测蛋白含量。各组取100 μg 上样，10%十二烷基硫酸钠（SDS） -聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）后湿法电转，10%SDS-PAGE 电泳后将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，将5% 脱脂奶粉室温封闭1 h，依次加入兔抗大鼠NF-κB 单克隆抗体及山羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶抗体，室温下孵育30 min，TBST 洗膜3 次，加入ECL 化学发光试剂，将PVDF膜放入暗盒中，压上X 胶片，取出胶片后显影、定影、清洗。然后，通过Image J 软件将条带灰度值数字化，目的条带与内参条带灰度比值为各目的蛋白相对表达量[10]。

1.3 统计学处理

采用SPSS 20.0 统计学软件分析。计量资料以表示，行t检验；计数资料以率（%）表示，行χ2检验。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾组织形态学变化

假手术组大鼠肾小球及肾小管清晰可见；模型组大鼠肾小管上皮细胞明显受累，肾小管管腔扩张，部分细胞核破裂，管型形成，肾小球有炎性细胞浸润；苦碟子组大鼠肾小管损伤程度明显轻于模型组，细胞核基本正常，肾小管内仅见少量管型。详见图1。

2.2 血清SCr 和BUN 水平

与假手术组比较，模型组大鼠血清SCr 和BUN 水平均显著升高（P ＜0.05）；与模型组比较，苦碟子组大鼠血清SCr 和BUN 水平均显著降低（P ＜0.05）。详见表1。

表1 3 组大鼠血清SCr 和BUN 水平比较（± s，n=10）

表1 3 组大鼠血清SCr 和BUN 水平比较（± s，n=10）

组别假手术组模型组苦碟子组F 值P 值剂量（mL/kg）4 4 4 SCr（μmol/L）43.41 ±3.25 197.56 ±11.43 89.28 ±5.47 1 098.323 0.001 BUN（mmol/L）6.84±0.58 23.83±2.36 11.27±1.49 286.754 0.000

2.3 肾匀浆IL-6，SOD，MDA 水平及NF-κB 蛋白表达水平

与假手术组比较，模型组大鼠肾匀浆IL-6 和MDA 水平及NF-κB 蛋白表达水平均显著升高，SOD水平显著降低（P ＜0.05）；与模型组比较，苦碟子组大鼠肾匀浆IL-6 和MDA 水平及NF-κB 蛋白表达水平均显著降低，SOD 水平显著升高（P ＜0.05）。详见表2。

表2 3 组大鼠肾匀浆IL-6，SOD，MDA 水平及NF-κB 蛋白表达水平比较（± s，n=10）

表2 3 组大鼠肾匀浆IL-6，SOD，MDA 水平及NF-κB 蛋白表达水平比较（± s，n=10）

组别假手术组模型组苦碟子组F 值P 值剂量（mL/kg）4 4 4 SOD/（U/mg）76.54±4.21 35.46±3.68 58.72±3.14 130.360 0.000 MDA/（nmol/mg）5.15±0.97 9.23±1.35 7.11±1.06 6.411 0.013 IL-6（ng/mL）105.27±21.18 1 482.21±84.32 655.36±57.44 431.620 0.000 NF-κB 蛋白0.11±0.02 0.82±0.04 0.34±0.02 1 327.268 0.001

3 讨论

肾脏在重获血流灌注后会释放过量的炎性介质，产生大量氧自由基，从而造成RIRI[5]。多种疾病可引起RIRI，同种异体肾移植更不可避免地会引起RIRI[11-12]。因此，RIRI 的早期预防具有重要临床价值。动物实验发现，苦碟子能通过抗氧化应激和抑制黏附分子表达等机制防护脓毒血症所致急性肾损伤[13]。

本研究中，镜下观察模型组大鼠肾小管明显肿胀，管腔扩张伴管型形成，肾小球有炎性细胞浸润，提示模型建立成功。肾脏在缺血再灌注后炎性反应较重，有一定程度的损伤，在再灌注前尾静脉注射苦碟子，肾小管损伤程度明显减轻。同时，苦碟子组血清SCr 和BUN 水平明显低于模型组，也提示苦碟子可改善RIRI 模型大鼠的肾脏功能。

SOD 是生物体内重要的抗氧化酶，反映机体清除氧自由基的能力。MDA 是脂质过氧化重要产物，可通过组织中MDA 含量评价脂质过氧化的程度，以间接测定氧自由基对组织细胞的损伤程度。肾脏发生缺血再灌注时，肾匀浆SOD 水平降低，MDA 水平升高。与模型组比较，苦碟子组大鼠的肾匀浆SOD 水平升高，而MDA 水平降低。提示大鼠肾缺血再灌注前使用苦碟子可增强肾组织的抗氧化能力，从而缓解氧化损伤，与杨洁等[5]的研究结果一致。氧自由基是RIRI 的重要介质，能攻击生物膜导致脂质过氧化损伤，引起细胞的肿胀变形，信号转导机制失灵，而苦碟子注射液中的活性成分经分析筛选发现能捕获超氧阴离子和羟自由基，达到抗氧化应激、抑制炎性因子表达的作用，从而降低血清MDA 水平，升高血清SOD 水平，缓解RIRI 的发生[14]。

NF-κB 是转录过程中RNA 聚合酶转录时所需要的一种辅助因子，炎性反应和氧化应激相互影响并参与细胞损伤过程，其共同的枢纽可能是NF-κB，其信号转导通路改变会引起多种炎性疾病发生。研究显示，NF-κB 信号通路参与RIRI 并通过对促炎等相关基因转录的调控影响IL-6 的表达，而IL-6 表达上调会加重肾脏的炎性反应[4，15]。故IL-6 和NF-κB 的表达量可评价RIRI 的程度。有报道显示，苦碟子可能通过下调脑缺血模型大鼠的Toll 样受体4（TLR-4），通过NFκB 信号转导通路，改善大脑缺血性损伤，且苦碟子可能在大鼠脑缺血过程中调节抗氧化能力，从而减轻其心肌损伤[16-17]。本研究结果显示，模型组大鼠IL-6 和NF-κB 蛋白表达水平较假手术组明显升高，苦碟子组较模型组明显降低，提示大鼠肾脏缺血后再灌注前使用苦碟子能明显抑制其再灌注损伤过程中IL-6 和NFκB 的表达，从而缓解肾脏炎性损伤。研究发现，从苦碟子中分离得到的部分倍半萜内酯类成分可抑制核因子κB 抑制蛋白（IκB）的磷酸化及降解，从而抑制NF-κB p65 的核转移，苦碟子可能是通过其含有的倍半萜内酯类成分抑制NF-κB 活性而影响IL-6 的表达，以缓解RIRI 的发展[12]。

综上所述，大鼠肾缺血后再灌注前使用苦碟子能缓解大鼠RIRI，其机制可能与抗氧化应激并下调NF-κB信号转导通路，从而缓解炎性损伤有关。