正交试验优选木姜叶柯中三叶苷提取工艺

王李婷，王向根，李 星，江仁峰，肖顺丽

（湖南医药学院药学院，湖南 怀化 418000）

木姜叶柯又名多穗石柯、甜茶，为壳斗科柯属植物木姜叶柯Lithocarpus litseifolius（Hance）Chun 的干燥嫩叶[1]。其为我国特有的植物资源，兼有茶、糖、药的功能，在民间应用已有上千年历史，具有清热解毒、化痰、祛风、降压作用，主要用于治疗湿热痢疾、皮肤瘙痒、痈疽恶疮等病症[2]。现代药理研究表明，木姜叶柯中的黄酮成分具有降血糖[3-4]、抗过敏[5]、抗氧化[6-7]、改善记忆力[8]等药理作用。三叶苷是木姜叶柯中黄酮类含量最高的成分，对于预防肥胖、糖尿病、心血管病和高血压有一定效果[9]，具有抑制糖尿病[9-10]、抗氧化[11]、促肝细胞增殖[12]等作用。本研究中以三叶苷含量为评价指标，采用正交试验法优选提取过程中液料比、提取时间、提取次数，为三叶苷的开发、利用奠定基础。现报道如下。

1 仪器与材料

1.1 仪器

1260 型高效液相色谱仪，包括G1311B 四元泵和G4212B 型二极管阵列检测器（美国Agilent 公司）；AUW120D 型电子分析天平（日本Shimadzu 公司）；Mighty-10 型超纯水机（上海砾鼎水处理设备有限公司）；RE-52CS 型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 试药

三叶苷对照品（四川省维克奇生物科技有限公司，批号为WKQ18052505，含量＞98.0%）；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。木姜叶柯药材样品购自君健中药材合作社，经湖南医药学院蔡伟博士鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1 三叶苷含量测定

2.1.1 色谱条件[13-15]

色谱柱：Agilent XDB -C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.5%磷酸水溶液（50 ∶50，V/ V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：280 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。在此条件下的色谱图见图1。

2.1.2 溶液制备

取三叶苷对照品适量，精密称定，加水制得对照品溶液。精密移取木姜叶柯提取液适量，以水定容至1 000 mL，摇匀，经0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

图1 高效液相色谱图

2.1.3 方法学考察

线性关系考察：分别精密量取对照品溶液0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL，置10 mL 容量瓶中，加水定容，摇匀，制成系列对照品溶液，取10 μL，按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积。以三叶苷质量浓度（X，μg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=25 683X+17.308（r=0.999 9）。结果表明，三叶苷质量浓度在0.012 3 ～0.246 0 mg/mL 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度、稳定性、重复性试验：试验按相关规定进行，结果仪器精密度良好，供试品溶液室温放置12 h 内基本稳定，方法重复性良好。

2.2 正交试验

以液料比（因素A）、提取时间（因素B）、提取次数（因素C）为三因素，三叶苷含量为评价指标，采用L9（34）正交表进行试验，因素水平见表1，数据采用SAS 8.2统计软件分析。

表1 因素水平表

正交试验设计及结果见表2，方差分析见表3。可见，以三叶苷含量为指标，木姜叶柯正交试验中考察因素的影响强度依次为C ＞B ＞A，且差异均有显著性（P＜0.05）。A 因素中，A3＞A2＞A1，故选择A3；B 因素中B2＞B1＞B3，故选B2；C 因素中，C3＞C2＞C1，故选C3。由此可推出，A3B2C3为最优方案，即液料比15 ∶1，提取3 次，每次1.5 h。

2.3 工艺验证

称取木姜叶柯3 份，每份10 g，按最佳工艺条件提取，测得三叶苷的含量分别为33.45% ，34.16% ，34.05%，平均33.89%，RSD为1.14%。

3 讨论

表2 L9（34）正交试验设计及结果

表3 方差分析结果

现有文献中关于木姜叶柯提取工艺大多为开发茶饮料进行的提取工艺考察，以多成分为指标，结果为液料比大，提取时间短，但三叶苷的提取率较低[13-14]。

本研究中参考文献[15-16]，以水为提取溶剂，以液料比、提取时间和提取次数为三因素。为节约生产成本和便于实际工业生产，液料比选择9 ∶1，12 ∶1，15 ∶1。预试验中发现，三叶苷的含量随着提取时间的延长而逐渐增加，故提取时间选择1.0，1.5，2.0 h。

本研究结果表明，各因素对提取效果影响强度依次为提取次数＞提取时间＞液料比；筛选出最佳提取方案为A3B2C3，即称取适量木姜叶柯，加入15 倍水，提取3次，每次1.5 h。在此工艺下三叶苷的平均含量为33.89% ，说明该提取工艺稳定，提取率高，可为大规模生产提供参考。