裸鼠乳腺癌模型评价拉帕替尼固体分散体的药效*

胡献跃，戴关海，王晨霞

（1. 金华职业技术学院，浙江 金华 321017； 2. 浙江省中医药研究院，浙江 杭州 310007）

晚期及转移性乳腺癌常与表皮生长因子受体（EGFR）族[包括EGFR，人表皮生长因子受体2（HER2），HER3，HER4]酪氨酸激酶的过度表达和激活有关。若乳腺癌患者HER2 过度表达时，疾病进展和死亡风险则显著升高[1-2]。甲苯磺酸拉帕替尼是EGFR 和HER2 双重抑制剂[3]，用于晚期或转移性乳腺癌的治疗[4-6]。但由于其在水中不溶，生物利用度只有10% ～20%[7]。固体分散技术将药物以分子、微晶、无定形态分散在适宜载体中，可提高药物（尤其是难溶性药物）的表观溶解度和溶出速率，从而提高药效[8]。本研究中以Soluplus® 为载体、ploxama188为增塑剂，通过药载比的调节，制备不同表观溶解度的固体分散体，并利用裸鼠乳腺癌模型、HER2 和EGFR蛋白表达水平测定，评价甲苯磺酸拉帕替尼固体分散体对移植瘤的抑制效果。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

仪器：Centrifuge 5810R 型离心机（Eppendorf，德国艾本德股份公司）；3111 型CO2水套培养箱（美国热电公司）；无菌超净台HR40-Ⅱ-A2 型（青岛海尔特种电器有限公司）；Agilent 高效液相色谱仪（包括1260 四元泵，1260DAD 检测器，1260 自动进样器，美国安捷伦科技公司）；NIS-Elements D 3.2 型图像分析仪（日本尼康株式会社）；卡尺及其他材料。

瘤株：人乳腺癌细胞株MDA-MB-231，由浙江省中医药研究院肿瘤所提供，液氮保存。

动物：BALB/c-nu 雌性裸小鼠，SPF 级，体质量19 ～22 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号为SCXK（京）2016-0006，动物合格证号为11400700303981，饲养条件为室温25 ℃，相对湿度70%，自由进食与饮水。实验动物使用许可证为SYXK（浙2014-0003）。

药物与试剂：甲苯磺酸拉帕替尼固体分散体[自制，批号为180502（1 ∶0.5 ∶0.5），180509（1 ∶1 ∶1），180512（1 ∶2 ∶1）]；TYKERB® 片（GSK，批号为17045073，规格为每片250 mg）；EGFR 一抗（批号为18986-1-AP）；HER2 一抗（批号为18299-1-AP），均由Proteintech公司提供；DMEM 高糖培养基（1X，批号为1801030303），RPMI.1640 培养液（1X，批号为1711140506），PBS 缓冲液（1X，批号为1804110105），均由吉诺生物医药技术有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 固体分散体制备

以Soluplus® 为载体、ploxama188 为增塑剂，采用溶剂挥发法制备固体分散体[9]，分别制备高水溶性固体分散体[Lapatinib ditosylat-Soluplus® -泊洛沙姆188（1 ∶2 ∶1）]，中水溶性固体分散体[Lapatinib ditosylat-Soluplus® -泊洛沙姆188（1 ∶1 ∶1）]和低水溶性固体分散体[Lapatinib ditosylat-Soluplus® -泊洛沙姆188（1 ∶0.5 ∶0.5）]。

1.2.2 表观溶解度测定

色谱条件：色谱柱为Agilent C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙酸铵溶液（pH 调至4）-乙腈（1 ∶1）；流速为1.0 mL/min；柱温为40 ℃；测定波长为260 nm。

测定方法：取甲苯磺酸拉帕替尼原料、TYKERB®片和固体分散体适量（约含拉帕替尼10 mg），置25 mL容量瓶中，加水适量，超声溶解20 min，加水定容，溶液在搅拌下置（25±1.0）℃平衡2 h，经0.45 μm 滤膜过滤，取续滤液，采用高效液相色谱法测定。

1.2.3 动物模型构建及分组

取雌性BALB/c-nu 裸鼠2 只，右腋皮下接种MDA-MB-231 细胞悬液（5×107/mL），每只0.2 mL，常规饲养50 d 后，脱颈处死，剥离皮下肿块，剪成2 ～3 mm的碎块，种植于50 只裸鼠乳腺脂肪垫下，缝合切口，术后继续无菌饲养。当肿瘤长到100 mm3左右时，开始分组、称重、给药[10]。按随机法分为5 组[高水溶性组（A1组）、中 水 溶 性 组（A2组）、低 水 溶 性 组（A3组）、TYKERB® 对照组（B 组）和模型组（C 组）]，每组10 只。给药组实验时取各药载比固体分散体和TYKERB® 粉末适量，加水配制为含拉帕替尼6.44 g/L 的混悬液，超声处理20 min，给小鼠灌胃体积为25 mL/kg，相当于灌胃拉帕替尼161.0 mg/kg；C 组灌水25 mL/kg。各组动物每日灌胃1 次，共6 周。

1.2.4 移植瘤体积测定和抑制效果检查

小鼠每周称重，并测量肿瘤最大长径（a）和横径（b），肿瘤体积（mm3）=（肿瘤长径×肿瘤短径2）/2。分别计算相对肿瘤体积和相对肿瘤增殖率（T/C，%），同时观察腋窝是否能触及肿大淋巴结，皮肤有无溃烂，裸鼠的活动状态及生长情况有无异常。实验结束时剥离实体瘤称重，计算抑瘤率[11]。

抑瘤率（%）= [（模型组平均瘤重-给药组平均瘤重）/模型组平均瘤重] ×100%

取原位肿瘤和肿大淋巴结进行HE 染色病理检查。

1.2.5 移植瘤中EGFR 和HER2 蛋白表达

采用免疫组化法测定各组移植瘤中EGFR 和HER2 蛋白表达量，肿瘤组织用10%中性福尔马林固定24 h 后，石蜡包埋、切片、脱蜡及复水、微波抗原修复、阻断内源性过氧化物酶、5%BSA 封闭、EGFR 和HER2 一抗孵育、二抗孵育、滴加SABC，DAB 显色、复染细胞核及脱水封片。结果采用NIS-Elements D 3.2 型图像分析仪分析，每张切片随机取5 个视野，阳性细胞为黄褐色颗粒着色，用平均光密度值表示EGFR 和HER2 的蛋白表达量[12]。

1.3 统计学处理

采用SPSS 20.0 统计学软件处理。计量资料用表示，组间比较采用单因素方差分析，并行正态分布检验和方差齐性检验。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 建模成功

实验中各组裸鼠的活动状态及生长情况无明显异常，部分裸鼠腋窝淋巴结出现肿大，未见皮肤溃烂现象。裸鼠剥离实体瘤镜下观察结果见图1。实体瘤质地较软，部分肿瘤中心有乳酪状坏死，乳腺结构受到破坏；肿瘤实体细胞丰富，缺少腺管状结构；肿瘤细胞排列不规则，增生活跃，可见细胞核分裂现象；癌巢周围可见淋巴细胞、浆细胞等细胞浸润。可见，病理符合乳腺癌组织病理特征，裸鼠造模可靠。

图1 MDA-MB-231 裸鼠移植瘤病理学检查结果（HE 染色，×400）

2.2 表观溶解度

测定结果表明，TYKERB® 与原料表观溶解度基本一致。固体分散体中载体Soluplus® 和增塑剂ploxama188 均为非离子型表面活性剂，具有胶束增溶作用，同时2 种高分子材料对药物的过饱和溶液具有很强的抑晶作用，维持拉帕替尼较高的过饱浓度，制备的固体分散体表观溶解度为TYKERB® 的6.2 ～16.3 倍。

表1 各组小鼠移植瘤生长体积变化比较（± s，mm3，n=10）

表1 各组小鼠移植瘤生长体积变化比较（± s，mm3，n=10）

注：与C 组比较，*P ＜0.05，#P ＜0.01；与B 照组比较，△P ＜0.05，▲P ＜0.01。表3 和表4 同。

组别A1 组A2 组A3 组B 组C 组W0 103.8±13.45 98.1±15.23 102.4±14.16 95.8±18.10 97.0±13.62 W1 114.8±21.82 112.6±24.31 120.6±29.52 116.6±28.66 132.9±26.49 W2 124.5±29.04#123.7±30.79#134.8±31.25*134.1±20.57#180.3±40.96 W3 140.9±34.69#145.1±38.11#164.7±35.27*169.8±33.79*242.2±94.63 W4 157.7±55.23#△163.4±41.55#△190.8±38.56#202.7±37.65*288.4±99.00 W5 179.2±59.82#△183.9±48.36#△220.9±51.24*239.1±43.57 349.4±173.61 W6 197.7±62.38#▲201.5±58.66#▲240.6±52.08*267.7±42.16*420.6±218.32

2.3 移植瘤体积变化

各组移植瘤体积变化见表1。第1 周，各组肿瘤体积增长无明显差异。给药2 周后，C 组小鼠肿瘤体积快速增长；与C 组比较，A1组和A2组抑瘤作用显著（P ＜0.01），A3组与B 组移植瘤增长也较C 组缓慢（P ＜0.05）。与B 组比较，A1组和A2组在第4 周后也显示更强的抑瘤作用（P ＜0.01）。

2.4 抑瘤效果

各组相对肿瘤增殖率结果见表2。可见，随着甲苯磺酸拉帕替尼表观溶解度的增加，对移植瘤的抑制效果更显著。各组抑瘤率结果见表3。可见，各固体分散体组较C 组比较均有显著差异（P ＜0.01），其中A1组和A2组与B 组比较，差异显著（P ＜0.05）。

表2 各组相对肿瘤增殖率（%）

表3 拉帕替尼对MDA-MB-231 裸鼠移植瘤生长的影响（± s，n=10）

表3 拉帕替尼对MDA-MB-231 裸鼠移植瘤生长的影响（± s，n=10）

组别数量（只） 体质量（g）瘤重（g）A1 组A2 组A3 组B 组C 组开始10 10 10 10 10结束10 10 10 10 10开始19.2±0.94 19.3±0.81 19.2±0.73 19.3±0.65 19.3±0.72结束18.8±2.05 18.8±1.15 18.9±1.12 18.8±1.09 19.6±0.82 0.332±0.110#△0.334±0.090#△0.357±0.088#0.442±0.093*0.659±0.233抑瘤率（%）49.6 49.3 45.8 32.9

2.5 EGFR 和HER2 蛋白表达

由图2 和图3 可知，各实验组和B 组对EGFR 和HER2 蛋白在肿瘤组织中表达的程度与C 组比较均明显减弱（P ＜0.05）。A1组和A2组对目标蛋白的抑制作用明显优于B 组（P ＜0.05）。详见表4。

图2 MDA-MB-231 裸鼠移植瘤中EGFR 表达量（×40）

3 讨论

甲苯磺酸拉帕替尼属BCS Ⅳ类药物，不溶于水，临床需要大剂量给药（1 250 mg/d）才能达到治疗效果。增加难溶性药物溶解度和溶出速率方法很多，如环糊精包裹、微乳、纳米混悬液、表面活性剂增溶、纳米脂质体、固体分散体、纳米晶等[13]。药物表观溶解度的增加，并不都能促进药物的透皮吸收，原因是在增加药物表观溶解度的同时导致药物渗透性下降[14]。而固体分散技术通过维持药物的过饱和状态来增加其溶解度，较少出现药物渗透性降低的情况[15]。

本研究中通过采用溶剂挥发法制备甲苯磺酸拉帕替尼固体分散体，使其表观溶解度较阳性对照药分别提高16.3 倍（1 ∶2 ∶1）、13.5 倍（1 ∶1 ∶1）、6.2 倍（1 ∶0.5 ∶0.5），再利用裸鼠乳腺癌模型评价其抑瘤作用。

图3 MDA-MB-231 裸鼠移植瘤中HER2 表达量（×40）

表4 移植瘤中EGFR 和HER2 表达程度（± s，%，n=10）

表4 移植瘤中EGFR 和HER2 表达程度（± s，%，n=10）

组别A1 组A2 组A3 组B 组C 组EGFR 23.4±3.79#▲24.1±4.13#△26.3±3.56#29.0±3.90#36.4±4.89 HER2 11.1±5.68#△11.4±5.20#△14.7±6.22#17.6±6.12#23.5±6.32

乳腺癌的发展常与EGFR 和HER2 过表达相关[2]，甲苯磺酸拉帕替尼通过氢键可逆地结合到EGFR 和HER2 酪氨酸激酶ATP 结合位点上，阻止ArIP 结合到酪氨酸激酶区，抑制酪氨酸激酶的自磷酸化和激活，从而抑制肿瘤细胞增殖和凋亡[16]。本研究中比较了各组对EGFR 和HER2 的抑制效果，从分子水平分析了固体分散体技术的增效作用。高水溶性组和中水溶性组中EGFR 和HER2 的表达量分别为模型组的64.29% ～66.21%和47.23% ～48.51%，均显著优于TYKERB® 阳性对照组的79.67% 和74.89% （P ＜0.05）。与各组移植瘤的体积和瘤重变化结果吻合。这可能源于甲苯磺酸拉帕替尼表观溶解度的提升，扩大了细胞膜渗透浓度梯度，促进了甲苯磺酸拉帕替尼的跨膜转运吸收。