瓜氨酸化蛋白及其短肽诱导性RA动物模型研究进展①

朱兴旺 宣亚男 万丽娟 赵晓峰 赵文婷 陈恩生 肖长虹

(南方医科大学中西医结合医院，广州 510315)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)实验动物模型研究是深入探讨人类RA疾病发生发展机制的最有效途径之一。目前广泛应用于RA研究的比较成熟的动物模型如佐剂诱导性关节炎(ardjuvant induced arthritis，AIA)模型、胶原诱导性关节炎(collagen induced arthritis，CIA)模型多为自限性，缺乏人类RA慢性侵蚀性特点，其血清中很少检测到类风湿因子(rheumatoid factor，RF)、抗环瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptide,CCP)等RA特异性自身抗体；而且同一种模型由于诱导剂乳化方法、注射剂量、注射部位的不同也表现出不尽相同的关节炎表现。因此，上述RA动物模型并不能完全反映人类RA在关节炎表现、免疫学、病理学等方面的特点，更无法阐明人类RA免疫炎症反应的启动和维持过程中的机制，制约RA研究的进一步发展。而目前有研究认为瓜氨酸化蛋白能充当启动RA免疫炎症反应的靶抗原，抗瓜氨酸免疫反应能诱导关节炎[1]；产生的抗瓜氨酸化蛋白抗体(anti-citrullinated protein antibody，ACPAs)能直接或间接介导软骨侵蚀、骨质破坏[2]，在RA的炎症反应和软骨侵蚀、骨质破坏过程中发挥关键作用。为进一步揭示瓜氨酸化蛋白、ACPAs的致病机制及获得一种更符合人类RA发病特点的动物模型，近年来国内外学者展开了以瓜氨酸化蛋白或其短肽作为抗原诱导剂建立RA动物模型的探索，现已可见几种瓜氨酸化蛋白诱导性关节炎模型的报道。本文就瓜氨酸化蛋白及其短肽诱导性RA模型进行综述如下。

1 瓜氨酸化蛋白诱导性RA模型

这些模型普遍的造模方法是在瓜氨酸化缓冲液中，体外通过肽酰基精氨酸脱亚胺酶(peptidyl arginine deiminase，PADs)催化蛋白发生瓜氨酸化后获取瓜氨酸化蛋白，再对大鼠或小鼠进行免疫。概括起来有以下3种类型：

1.1瓜氨酸化Ⅱ型胶原蛋白诱导性关节炎大鼠模型 2005年瑞典学者Lundberg等[3]在他的研究中建立了首个瓜氨酸化蛋白诱导性关节炎模型。他在体外37℃条件下，以2U PADs催化1 mg兔源Ⅱ型胶原蛋白获得瓜氨酸化Ⅱ型胶原作为抗原诱导剂，然后将瓜氨酸化Ⅱ型胶原与等容量弗氏佐剂进行乳化，再将含120 μg瓜氨酸化Ⅱ型胶原的乳化液对9～14周龄的雌性Lew.1AV1大鼠尾根部进行注射免疫。该模型关节炎的发病率约为80%，发病时间出现在免疫后第13天，相比对照组发病率更高，关节炎发生更早。Lew.1AV1大鼠自第13天发病后关节炎逐渐加重，至免疫后第28天其关节炎指数可达14分，持续至第38天仍保持较高的关节炎指数评分；并且发病大鼠关节病理存在滑膜细胞增生及软骨降解等组织学改变。但是，研究中并未详细交代关节炎大鼠受累的关节数目、部位和关节变形等情况，在组织学上也未详细描述其滑膜增生程度、炎细胞浸润程度、骨侵蚀等病理改变。这可能与该研究的侧重点不在于评价关节炎模型特点，而在于明确关节炎大鼠血清中抗CCP抗体等ACPAs的存在以及免疫前后关节软骨、细胞上是否存在瓜氨酸化蛋白沉积以及对关节炎发病、严重程度的影响。该研究最终证实瓜氨酸化蛋白具有更强的免疫原性和致关节炎性，它们在关节中的沉积与关节炎的严重程度呈正相关。

1.2以转基因小鼠建立的关节炎模型 第2种类型的瓜氨酸化蛋白诱导性关节炎模型则是选择HLA-DRB1*0401(HLA-DR4 IE)转基因小鼠作为造模载体，以此克服人类RA疾病遗传易感因素。在瓜氨酸化蛋白的获取上，与2005年Lew.1AV1大鼠关节炎模型瓜氨酸化Ⅱ型胶原相似，同样是在体外37℃的瓜氨酸化缓冲液中，通过PADs催化原型蛋白获得，其差别在于PADs与蛋白催化反应的用量、时间有所不同。而其造模方法与传统的CIA模型基本相同，即首次免疫以含等容量完全弗氏佐剂的瓜氨酸化蛋白乳化液在小鼠的大腿、腹部内侧或尾根部皮下注射，加强免疫则在首次免疫后的第21天以含等容量的不完全弗氏佐剂的瓜氨酸化蛋白乳化液皮下注射。那么，第1个小鼠模型是2008年Hill等[4]建立的瓜氨酸化纤维蛋白原诱导性HLA-DR4 IE转基因小鼠关节炎模型。该模型的发病率较低，为35.5%，受累关节主要在后足踝关节，仅有1只小鼠在前足出现一个趾炎。其关节炎表现为一个渐进的慢性发病过程：首次免疫的第3周小鼠踝关节开始出现轻度肿胀，持续加重伴明显发红，至第10周关节红肿达高峰，随后逐渐消退，150 d观察到关节强直，部分小鼠于免疫后200 d仍有关节肿胀。免疫学分析显示关节炎小鼠具有瓜氨酸化蛋白特异性T淋巴细胞增殖反应以及释放大量的IFN-γ、IL-10等炎症细胞因子，产生针对瓜氨酸化蛋白的特异性IgG抗体，揭示其免疫病理是以Th1细胞为主导，B淋巴细胞参与的免疫应答过程。组织学表现为早期以淋巴细胞为主的炎症细胞浸润、滑膜细胞增生、血管翳形成以及随后出现的软骨、骨质侵蚀，后期则出现滑膜组织纤维化。接着，2011年Kinloch[5]在探讨人类α烯醇酶和牙龈卟啉单胞菌烯醇酶致关节炎研究中建立人和牙龈卟啉单胞菌瓜氨酸化α烯醇酶诱导性DR4-IE转基因小鼠模型。这两个模型特点相似，发病率分别为75%和100%(人9/12，牙龈卟啉单胞菌6/6),均具有快速致关节炎的特点，即首次免疫后2～3 d小鼠关节出现红肿，缓慢加重至第24天达高峰，此时尽管踝关节发红消退但肿胀依然存在；血清产生针对瓜氨酸化α烯醇酶的特异性ACPAs;而实验中作为对照的MHCⅡ基因缺失的C57BL/6小鼠和野生型C57BL/6小鼠均无关节炎发生，血清中也没有产生ACPAs，揭示RA遗传易感基因在该关节炎模型发病中的重要意义。进一步的关节病理学显示该模型踝关节甚至在部分跗骨关节出现明显滑膜增生、软骨侵蚀和骨质破坏，但是缺乏明显的中性粒细胞浸润，这与瓜氨酸化纤维蛋白原诱导性转基因小鼠模型的组织学表现相似。

1.3不含佐剂的瓜氨酸化Ⅱ型胶原诱导性关节炎模型 2012年Thiele[6]以无佐剂的瓜氨酸化鼠Ⅱ型胶原免疫DBA/1j小鼠诱导出关节炎模型。其造模方法与先前的瓜氨酸化蛋白诱导性关节炎模型最大的区别在于作为诱导剂的瓜氨酸化Ⅱ型胶原不与佐剂进行乳化，而直接对小鼠进行免疫注射，并且采用每周1次注射，连续4周的诱导方式。众所周知，弗氏佐剂本身可诱导佐剂性关节炎，而采用不含佐剂的瓜氨酸化蛋白进行免疫诱导可排除佐剂对关节炎发生发展的干扰，进一步确定瓜氨酸化Ⅱ型胶原的致病作用。此外，采用同源的瓜氨酸化鼠Ⅱ型胶原作为抗原诱导剂，同样表明瓜氨酸化蛋白具有更强的免疫原性和致关节炎性。这对确立瓜氨酸化蛋白可能作为关节炎的启动抗原提供更好的依据。

该DBA/1j小鼠模型的发病率为100%，关节炎累及四肢关节，但以后足关节为主且较严重。典型的关节炎体征在首次免疫后3周出现，第5周红肿达高峰，第6周逐渐消退。病理学见关节内滑膜增生、炎症细胞浸润、软骨与骨质侵蚀。影像学显示受累关节软骨与骨质侵蚀、骨量丢失、骨破坏等征象。免疫学分析显示瓜氨酸化Ⅱ型胶原特异性的T淋巴细胞明显增殖，并释放IL-6、IL-23等炎症细胞因子，分泌ACPAs且以抗CCP抗体明显升高为特点，这表明细胞免疫和体液免疫在该模型的免疫病理过程发挥重要作用。后来Thiele的研究团队重复该关节炎模型，进一步揭示病变关节出现更严重的软骨胶原降低、软骨侵蚀等骨损伤表现，并与血清中总ACPAs和抗瓜氨酸化Ⅱ型胶原抗体滴度呈正相关[7]。这与人类RA的发病特点极为相似，提示瓜氨酸化蛋白抗原与ACPAs的产生可直接介导骨损伤。

2 以瓜氨酸化蛋白短肽建立的关节炎模型

由于上述这些模型所选用的瓜氨酸化蛋白种类、免疫诱导方法不尽相同，特别是体外PADs催化效率不明确、所获取的瓜氨酸化蛋白需经过一系列纯化、鉴定等繁琐过程，各个模型间差异较大。纵观近10年来，这些瓜氨酸化蛋白诱导性关节炎鼠模型并没能得到更深入的研究。因此，继续寻找一种合适的抗原及合适的造模方法，是进一步开发该模型所面临的问题。早在1994年Brand等[8]就已证明Ⅱ型胶原蛋白肽段具有很强的刺激DBA/1小鼠产生T淋巴细胞增殖的能力，而且以CB11(CⅡ124-420)多肽段成功诱导DBA/1小鼠产生CIA。这提示多肽具有致关节炎的潜能。并且，已有研究表明瓜氨酸化蛋白短肽同样具有免疫原性，而且人工合成的环状瓜氨酸化蛋白短肽较线性形式免疫原性更强，它们均可以诱导瓜氨酸化蛋白特异性的T淋巴细胞增殖反应[9,10]，但是这些短肽能否诱导关节炎，国内外尚未见报道。

于是，我们的团队率先开展以环状瓜氨酸化蛋白短肽诱导关节炎模型的探索，并已证实偶联血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)的环状瓜氨酸化波形蛋白短肽能诱导DBA/1小鼠产生关节炎，而未偶联KLH的环状短肽未能诱导小鼠发生关节炎[11]。首先我们筛选具有免疫原性的瓜氨酸化波形蛋白的第26～44位氨基酸序列为基础短肽[10]，人工合成环瓜氨酸化波形蛋白短肽，并将KLH与该环状短肽进行偶联合成偶联肽。接着将上述环状短肽、偶联肽分别与弗氏佐剂进行乳化，形成终浓度为1 mg/ml的乳化液。小鼠分别于第0天接受首次免疫注射乳化液0.2 ml及第21天进行强化免疫注射乳化液0.1 ml，采用鼠尾根部、背部多点皮下注射，并以CIA模型作为阳性对照。首次免疫后第5周偶联肽组小鼠开始观察到1只小鼠单个后足趾中度红肿，逐渐减轻，持续2周后恢复正常；另2只小鼠于第6周才出现轻度的后足跖部红肿，持续至第8周急速加重，以双后足明显红肿为主，伴关节活动受限，随后又快速减轻，约1周后红肿基本消退，其发病率仅为25%(3/12)，关节炎指数最高仅为8分，观察周期内未发现明显的关节畸形。这显然与既往的瓜氨酸化蛋白诱导性鼠模型及CIA模型特点不同。而单纯的环状短肽组未发现小鼠出现关节炎，这表明偶联KLH的环状短肽具有更强的免疫原性，能诱导关节炎发生。进一步的关节病理显示病变关节仅有轻度的滑膜增生，缺乏明显的炎症细胞浸润，也无明显骨质破坏，这与上述转基因小鼠关节炎模型的病理特点相似，与CIA模型明显不同。在对血清ACPAs的检测上，偶联肽组可以检测到抗CCP抗体、AKA等自身抗体的存在。有趣的是，偶联肽组3只关节炎小鼠血清中均产生AKA抗体，另3只无关节炎的小鼠血清AKA也出现阳性，而CIA组小鼠血清的阳性率仅为16.67%(2/12)。这个临床表现与血清学表现相对应正好证明该偶联肽关节炎模型的可靠性，提示那些血清AKA阳性而未发展为关节炎的小鼠已经对瓜氨酸化蛋白短肽产生特异性免疫应答。如果延长观察周期，或许可以发现更多的小鼠出现关节炎。尽管该偶联环状短肽诱导性关节炎模型与CIA以及人类RA尚存在较大的差别，但我们的研究证实偶联肽具有更强的免疫原性和致关节炎作用，对建立短肽诱导性关节炎模型的进一步探索提供方向。

3 问题与展望

人类RA是一种异质性较强的慢性自身免疫性疾病，其发病涉及遗传易感因素、环境、感染、自身免疫状态等多种因素的影响。现有的RA疾病动物模型包括CIA、AIA等多种常见关节炎模型都无法全面模拟人类RA发病过程的所有特点；作为诱导CIA、AIA的Ⅱ型胶原蛋白、佐剂也并不是RA发病的真正启动抗原。因此，建立一种能较全面模拟人类RA发病经过的实验动物模型，不仅要克服疾病易感的遗传背景，还需要找到一种能启动人类RA免疫病理改变的始动抗原。纵观这些瓜氨酸化蛋白及其短肽诱导性关节炎动物模型的建立过程，可以看出作为实验对象的鼠类大多已转入HLA-DRB1*0401(HLA-DR4 IE)基因或自身携带有H-2q基因以克服RA疾病易感的遗传因素。尽管众多研究表明瓜氨酸化蛋白是人类RA发病的候选靶抗原，但是造模所用的瓜氨酸化蛋白均来自体外PADs的催化反应获取，难以模拟体内瓜氨酸化作用以及瓜氨酸化蛋白在体内的免疫病理过程。人工合成的瓜氨酸化蛋白短肽具有比瓜氨酸化蛋白易获得、易纯化等优势，但其免疫原性同样受空间结构的影响。研究表明具有β转角结构的环状短肽具有更好的诱导免疫应答的性能[12]，而我们的研究中所采用的环状短肽并未能确保该结构的成功合成；并且，单纯的环状短肽氨基酸序列少，分子量小，其免疫原性弱，这也是我们采用偶联KLH来增强其免疫原性的原因。正是由于存在上述诸多缺陷，使得这些瓜氨酸化蛋白及其短肽诱导性关节炎模型在造模成功率、关节炎特点、病理特征等方面存在较多差异，也没有显示出更多比CIA、AIA等模型更能代表人类RA病情特点的优势。然而，这些模型却有着以瓜氨酸化蛋白特异性的T淋巴细胞增殖、产生高水平ACPAs及相关炎症细胞因子的共同免疫学特征以及慢性病理过程，甚至后期出现明显的软骨侵蚀、骨质破坏等表现；这些似乎更符合人类RA的病情特点。因此，进一步寻找合适的瓜氨酸蛋白及其短肽作为免疫诱导剂，优化造模方法，选择遗传背景、解剖学、免疫学等与人类更亲近的实验动物作为研究对象，有望建立一个更能反映人类RA发病全过程的瓜氨酸化蛋白诱导性关节炎模型，这对深入探讨RA的发病机制，特别是瓜氨酸化蛋白及ACPAs如何启动免疫应答的发病机制具有重要作用。