胸腺上皮细胞自噬在T细胞分化发育中的研究进展①

邢君娜 王金丽 何新新 刘 婷 李 彬

(河北医科大学第二医院，石家庄 050000)

胸腺作为哺乳动物重要的中枢免疫调节器官，是T细胞分化发育成熟的主要部位，并可分泌多种胸腺激素及激素类物质[1]。胸腺为T细胞分化发育提供了最适宜的微环境,胸腺微环境主要由胸腺基质细胞(thymic stromal cells,TSCs)、细胞外基质(extracellular matrix,ECM)和细胞因子组成。其中胸腺基质细胞类型较多，包括胸腺上皮细胞(Thymic epithelial cells，TECs)、树突状细胞、巨噬细胞、成纤维细胞等，其中TECs是胸腺微环境中最重要的成分，通过细胞与细胞间的相互作用及分泌一些可溶性分子影响不同发育阶段的胸腺细胞发育成熟[2]。TECs根据其在胸腺中位置不同，分为分布在胸腺外侧皮质的皮质胸腺上皮细胞(cortical thymic epithelial cells，cTECs)和分布在髓质的髓质胸腺上皮细胞(medullary thymic epithelial cells，mTECs)，胸腺细胞的发育和成熟是通过在胸腺皮质和髓质上皮细胞的迁移过程中相互作用完成的[3]。近期研究表明，相比大多数其他组织，TECs具有异常高的自噬体的数量。自噬的遗传干预,尤其是在TECs，会改变 T细胞特异性选择，导致严重的大肠炎与多器官炎症[4]。本文就胸腺上皮细胞内自噬在如何影响T细胞在胸腺内成熟作一综述。

1 自噬及其分子机制

自噬是一种由溶酶体介导的，通过对细胞质成分、细胞器降解和再循环，维持细胞内环境稳定的过程[5]。由于自噬是几乎所有类型细胞维持其稳态所需的基本过程，所以细胞内均保持基础水平的自噬[6]。除此之外，自噬对于细胞在饥饿、活化、生长和增殖等应激条件下至关重要，为细胞提供必需的代谢中间体。这些基本的自噬功能与疾病和衰老有关，因为聚集的蛋白质，受损的细胞器或其他分子的积累是许多疾病的潜在问题。例如，自噬涉及克罗恩病、肿瘤、衰老和囊性纤维化等神经退行性疾病，以及代谢相关疾病[7-9]。此外，自噬可以直接降解入侵病原体(异种自噬)，从而起到细胞自主免疫的作用[10]。自噬有三种不同类型，即分子伴侣介导的自噬、微自噬和巨自噬。其中巨自噬是最独特的，因为它在胞质装载过程中形成了双膜结构，即自噬小体[11]。此外，也是研究最深入的自噬类型，并且由于这篇综述涉及巨自噬，它将在下文中简称为“自噬”。

自噬的过程由成核、延伸、融合和降解四个不同的阶段组成，降解的氨基酸等小分子物质释放回细胞质以提供细胞的代谢功能[12]。自噬相关基因(autophagy relative gene，Atg)依次参与组装并被锚定在双层膜上来识别吞噬复合物，这最终导致吞噬复合物与细胞液隔离。到目前为止，在酵母中已有36个Atg蛋白质被确定,形成自噬过程中不同的功能复合物[13]。自噬起始时，由UNC-51样激酶1(ULK1)、200KDaFAK家族交叉蛋白(FIP200)和mATG101组成的ULK1复合物被募集到杯状隔离膜的组装位点上，ULK1复合物通过去磷酸化被激活后，开启自噬通路[14]。磷脂酰肌醇3-羟基激酶(PI3K，也称为hVsp34)复合物由hVsp34、p150、Beclin1和 Atg14L组成，有助于磷脂酰肌醇3-磷酸(PI3P)产生，提供脂质信号并招募其他自噬效应器到吞噬泡促进自噬的形成，如双FYVE域蛋白(DFCP1)和WD重复蛋白与磷酸肌醇(WIPI)家族成员相互作用[15]。杯状隔离膜成核后，两种泛素样结合系统：Atg12-Atg5和微管相关蛋白1轻链3(LC3)-磷脂酰乙醇胺(PE)途径，在自噬的延伸及闭合中发挥重要作用。在Atg12-Atg5途径中，Atg7(E1泛素活化酶)活化后转移至Atg10(E2泛素缀合酶)，Atg12与Atg5的内部赖氨酸(底物蛋白)共价结合，形成Atg12-Atg5复合物，其进一步与Atg16L相互作用形成Atg12-Atg5-Atg16L复合体[16]。在LC3-PE途径中，LC3由Atg4(一种半胱氨酸蛋白酶)处理以暴露一种C-末端甘氨酸残基，形成LC3I。然后，LC3I被激活并由Atg7转移到Atg3(E2泛素结合酶)形成LC3I-Atg3复合物。最后，LC3I与PE共轭，形成LC3II-PE复合物，其在自噬体的形成及中必不可少[17]。在自噬小体形成后，自噬小体被运输到溶酶体并与其融合，形成自噬溶酶体，溶酶体内的一系列酸性水解酶将其内容物降解，并释放到细胞质中被重新利用。该过程由溶酶体相关膜蛋白2(LAMP-2)、Rab7、紫外线辐射抗性相关基因(UVRAG)、ANARE和运输所需的内体分选复合物(ESCRT)介导[18]。

2 T细胞在胸腺内分化发育的阶段

T细胞在胸腺内发育是一个复杂的过程。T细胞的选择和成熟受胸腺细胞与胸腺皮质和髓质TECs之间的相互作用及其分泌的细胞因子调控[19,20]。主要是通过产生特异性T细胞受体(T cell receptor，TCR)并通过识别自身抗原，形成自身耐受性T细胞，从胸腺输出到外周的过程[21]。胸腺细胞作为T细胞的前身细胞在胸腺内的分化发育是一个连续的过程，大体上可以分为三个阶段：①双阴性细胞(Double negative，DN)阶段：来自骨髓的淋巴干细胞迁移至被膜下区，位于此区的胸腺细胞为CD4-CD8-双阴性细胞[22]。②双阳性细胞(double positive，DP)阶段：首先，根据CD25和CD44可进一步区分CD4-CD8-双阴性细胞的分化程度：CD44+CD25-(DN1)→CD 44+CD25+(DN2)→CD44-CD25+(DN3)→CD44-CD25-(DN4)[23]，其中Tcrb，Tcrg和Tcrd(分别编码TCRβ，TCRγ和TCRδ链)基因位点的重排开始于DN2阶段并在DN3阶段完成[24]。而Tcrb重排对于大多数胸腺细胞向αβT细胞谱系分化至关重要。不能产生TCRβ链的胸腺细胞不能进一步成熟并发生凋亡。通过功能性TCRβ链表达启动的过程被称为β选择。它涉及新生TCRβ链与恒定的pre-Tα(pTα)链配对形成pre-TCR过程，为DN4和DP阶段的存活和进展提供必需信号[25]。β选择涉及大约5轮的增殖，在此期间，胸腺细胞下调CD25的表达成为DN4细胞，然后迅速上调CD4和CD8。分化为成熟的CD4+CD8+双阳性细胞[26]。③单阳性细胞(single positive，SP)阶段：双阳性细胞在受到cTECs呈递的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)肽复合物时激活，并进一步诱导分化为SP阶段。在这个阶段中，与MHC-Ⅰ分子识别的形成CD8SP细胞，与MHC-Ⅱ分子识别的成为CD4SP细胞。从而进一步分化发育为只表达CD4+或CD8+的单阳性细胞[27]。

3 自噬与T细胞分化发育过程

胸腺细胞的成熟过程实质上是一种选择过程，主要包括cTECs中的阳性选择过程和mTECs中的阴性选择过程[28]。阳性选择是指在胸腺皮质的cTECs中，T细胞表面表达的TCR能和自身MHC识别的T细胞被允许增殖、分化、发育成为成熟T细胞的过程，使其具有自身MHC限制性。也就是双阳性胸腺细胞发育成熟为单阳性胸腺细胞的过程[29]。通常，MHC-Ⅰ类分子提呈细胞内抗原给CD8+T细胞，MHC-Ⅱ类分子提呈细胞外抗原给CD4+细胞[30]。阴性选择是指在胸腺髓质mTECs中，对自身抗原应答而不能识别异体抗原的单阳性胸腺细胞发生克隆缺失，即赋予其自身耐受性[31]。

研究表明，TECs是唯一的非造血细胞组成性表达MHC分子[32]，与专业的APC相比，其在捕获和处理细胞外抗原的功能较弱[33]，表明了MHC提呈过程中可能的细胞内替代途径。内源性加载MHC分子的候选途径可能是TAP依赖途径、分子伴侣介导的自噬及巨自噬[34]。其中，巨自噬被证明在其抗原提呈过程中可以与MHC相交叉，即细胞内抗原被吞噬后，自噬小体与MHC区室而不是溶酶体相融合，从而提呈抗原表位[35]。且用绿色荧光蛋白(GFP)-LC3转基因小鼠研究中发现，TECs具有强烈的饥饿独立的自噬活性。而在许多其他组织中，如肌肉等，仅在饥饿时自噬才被诱导并被检测到[36]。表明TECs中自噬对胸腺内T细胞选择中抗原呈递过程中不可或缺。

3.1自噬与T细胞的阳性选择过程 胸腺皮质内T细胞阳性选择过程是胸腺细胞表面形成的TCR与自身MHC识别的过程。能与自身MHC识别的胸腺细胞允许其克隆增殖，否则将发生凋亡[25]。通过自噬体标记物LC3与胸腺冷冻切片中的H2-DM阳性区室共定位，获得了功能性证据证明了TECs中自噬的关键作用是产生阳性选择肽/MHC-II类配体[37]。因此，胸腺细胞TCR配体的形成对于其阳性选择过程有着微弱的作用。此外，为了检测自噬在T细胞选择中的作用，将Atg5-/-或野生型小鼠胸腺移植到成年野生型小鼠，发现Atg5缺陷小鼠与野生型小鼠相比胸腺细胞数量发生了明显变化。而对其TECs中MHC分子的表达水平进行检测发现，MHC-Ⅰ类分子的表达正常而MHC-Ⅱ分子表达水平有轻微的降低。为进一步验证，通过对几种MHC-Ⅱ限制性转基因小鼠自噬干预，表明HA-TCR受体、SEP-TCR的血凝素和同源肽的呈递通过自噬促进，而通过AND和DEP TCR识别的同源肽的加载均未通过自噬促进。除此之外，DO11.10 TCR特异性肽加载甚至似乎被自噬负调控。同时，对MHC-Ⅰ限制性转基因TCR研究中发现，自噬的缺失对其配体的形成无明显影响[38]。这些结果支持自噬和其他MHC加载途径在阳性选择期间通过促进特定肽的呈递来影响T细胞库形成过程的假设。

为了证明自噬确实能够模拟MHC-Ⅱ配体的组成，考虑到体外分离的TECs数量有限，不能进行MHC配体的全面评估，应用B-淋巴母细胞系在自噬存在或缺失时对MHC-Ⅱ结合肽进行质谱分析[39]。为了观察cTECs上特定的MHC-Ⅱ类结合肽是否受到自噬的遗传干扰的影响，研究中使用了一种单克隆抗体(Y-Ae)，它在被I-Ea来源的肽占据时识别I-Ab。通过对IE和IA分子的共分选，I-Ea52-68-I-Ab复合物在造血抗原呈递细胞上(占所有I-Ab-肽复合物的10%)富集[40]。值得注意的是，这种复合物在cTEC上的代表性相对较低，并且假设这是由于cTEC以其特异性方式表达和/或处理的肽竞争结合I-Ab。当分析来自F1(BALB/c×C57BL/6)Atg5-/-的cTECs时，发现与野生型对照相比I-Ea52-68-I-Ab复合物富集增加，而总MHC-Ⅱ水平却相反[38]。这些发现提供了Atg5缺陷引起cTECs的MHC-Ⅱ配体的定量转变的直接证据，进一步表明cTECs中I-Ea52-68-I-Ab复合物的增加与自噬缺失引起的MHC-Ⅱ类结合肽降低，从而引起与I-Ab竞争结合减弱。

3.2自噬与T细胞的阴性选择过程 自噬除了在阳性选择中的作用之外，在mTECs中组织限制性抗原(tissue-restricted antigens，TRAs)呈递的阴性选择过程中的功能是有争议的[41]。尽管在正常条件下，研究显示cTECs和mTECs中LC3表达在后者中程度较低，且通过LC3和MHC-Ⅱ区室共定位也证实了自噬的分布[42]。此外，当抗原水平非常高时，自噬对于mTECs和APCs的多肽呈递似乎是不必要的，APCs可以间接诱导阴性选择。但在抗原水平较低时，mTECs中自噬依赖性肽的表达变得不可或缺[43]。

为了研究自噬在mTECs阴性选择中的作用，有研究将Atg5缺陷型小鼠胸腺移植到无胸腺裸鼠体内，导致了由免疫介导的组织炎症浸润及自身免疫性疾病的发生。且当从该嵌合体分别转移纯化的CD4+和CD8+T细胞至裸鼠体内时，CD4+T细胞比CD8+T细胞更易于诱发自身免疫性疾病，与Atg5缺陷的胸腺相一致，主要扰乱了CD4+T细胞的选择[44]。但是这种自身免疫反应的发生是否由于自噬缺失导致的阴性选择过程中自身反应性T细胞的产生还是由胸腺输出功能的损伤导致的淋巴细胞减少，还有待研究进一步证实。最近，Aichinger等[45]观察了自噬存在或缺失时T细胞在阴性选择中是否能够识别mTECs表达和呈递的自身抗原以及免疫逃逸现象的发生。首先，追踪了识别模型抗原鸽细胞色素c/CYCS(PCC)的T细胞，发现当PCC以其天然形式表达为TECs中线粒体自身抗原时，在特异性CD4+T细胞阴性选择过程中MHC-Ⅱ直接呈递过程需要完整的自噬途径。值得注意的是，当PCC表达为膜蛋白时，该过程却独立于自噬。表明抗原的亚细胞分布影响抗原的直接过程是否依赖于自噬。此外，通过对相同的mTECs特异性抗原与“天然”和“突变”LC3融合，研究其是否靶向自噬体降解，结果表明当表达相同水平抗原时，与突变组相比，自噬小体靶向模型抗原且特异性CD4+T细胞的阴性选择过程效率更高[46]。

4 小结

正常机体的免疫系统能有效地区分“自身”与“异己”成分[47]。免疫系统对自身抗原的无反应性是通过免疫耐受机制而形成。T细胞在胸腺发育期间，每个T淋巴细胞表面都会产生唯一且特异的TCR，由于其随机性，这个过程不可避免地也会导致潜在的可能会识别“自我”的T淋巴细胞的产生[48]。自身耐受机制的破坏常导致多发性硬化、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病的发生[49,50]。胸腺在形成中枢免疫耐受以及指导T细胞发育中有着重要的作用[51]。综上所述，TECs中自噬缺陷所引起的阳性选择和阴性选择的干扰可能协同促进自身免疫。首先，cTECs上MHC配体组成的改变可能影响阳选，影响胸腺细胞TCR的形成，可能会促进自身免疫。其次，mTECs损害的TRAs的呈递可允许本应被克隆删除或者偏向调节性T细胞谱系的自体反应性胸腺细胞输出到外周。因此，通过对胸腺上皮细胞内自噬进行干预有可能通过影响T细胞在胸腺内分化发育、成熟的过程，减少使自身反应性T细胞输出，从而预防自身免疫反应的发生，有可能成为未来治疗及预防自身免疫疾病发生发展的新靶点和方向。