PRMTs在肿瘤发生、发展中的作用及机制*

沈昊，张玲，刘修恒

（1.武汉大学人民医院 泌尿外科，湖北 武汉 430060；2.荆州市中心医院 病理科，湖北 荆州 434020）

细胞的正常生长依赖于控制细胞生长、分裂，以 及细胞分化、死亡多种基因的适当调节和相互作用。研究表明[1]，染色质修饰在调节细胞不同阶段的生长和分化过程中发挥着核心作用，其中染色质的组蛋白修饰是基因转录、DNA 复制和修复等重要生物学过程的首要条件之一。组蛋白的N-端与DNA 接触部分存在多种修饰方式，目前研究最多的是甲基化修饰。组蛋白的精氨酸甲基化修饰是染色质最重要的修饰方式之一，与许多细胞生理过程有关，包括信号转导、转录调控、RNA 加工处理、DNA 重组和修复等[2]。蛋白精氨酸甲基转移酶（protein arginine methyltransferases, PRMTs）是催化这种反应唯一的一类酶。PRMTs 具有催化多种细胞内蛋白质中特定精氨酸残基甲基化的能力，通过将甲基从S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylme-thionine, SAM）转移到目的蛋白质精氨酸残基的胍基氮分子上，使之发生甲基化，从而调控特定蛋白质的生物学功能[3]。根据PRMTs 甲基化方式和蛋白序列的不同，PRMTs 的家族成员可以分为4种类型：Ⅰ型PRMTs（包括PRMT 1、2、3、4、6 和8）催化ω-NG 单甲基化和ω-NG、NG 不对称双甲基化，Ⅱ型PRMTs（包括PRMT5 和PRMT9）催化ω-NG 单甲基化和ω-NG、N’G 对称双甲基化，Ⅲ型PRMTs（包括PRMT7）只能催化单甲基化，Ⅳ型PRMTs 催化δ-NG 单甲基化（该酶的活性仅限于在酵母Rmt2 中）[3]。

PRMT5 又称为Jak 结合蛋白1，是PRMTs 家族中最早鉴定出来的成员，其在肿瘤发生、发展中的作用被研究得最为深入。该蛋白是POLLACK 等[4]在酵母双杂交系统中研究Janus tyrosine kinase 2 在细胞信号中的作用时筛选出来的蛋白。PRMT5 在所有真核生物中普遍表达，其催化域结构和功能从人类到细菌高度保守。PRMT5 具有许多重要的生理功能，例如核糖体和高尔基体的生物合成、细胞的增殖、凋亡和分化等[5]，能够对称性的双甲基化某些蛋白质底物的精氨酸残基，包括染色质的组蛋白、剪接体蛋白等[6]，在表观遗传学水平调控其他重要癌基因和抑癌基因的表达，如Cyclin D1、肿瘤抑制基因致瘤性抑制基因7（suppressor of tumorigenicity,ST7）、NM23、p53、PDCD4、E2F-1和E-cadherin等，参与多种细胞内的生物过程，调控细胞的生长增殖、凋亡及侵袭转移过程，以及多个主要信号通路的调节。现就PRMT5 在肿瘤的发生、发展过程中的作用及其机制进行综述。

1 PRMT5 的结构和生物学功能

PRMT5 的结构在自然界中高度保守，无论是线虫、非洲爪蟾还是人，PRMT5 都含有位于N-端的三聚磷酸异构酶（triosephophate isomerase, TIM）结构域，位于中间的Rossmann 折叠，以及位于C-端的SAM结合蛋白结构域[7]。PRMT5 的N-端TIM 结构域不仅可以与其他PRMT5 相互结合，形成PRMT5 的四聚体，而且可以与甲基转移酶复合体蛋白50（Methylosome protein 50, MEP50）特异性结合。MEP50 是PRMT5 最常见的伴侣蛋白，与PRMT5 按1 ∶1 比例共同形成一个八聚体复合物，MEP50 可以增强PRMT5 对目的蛋白的选择和识别能力，从而提高PRMT5 的甲基转移酶活性[8]。PRMT5 作为表观遗传调节酶，通过与包括染色质结合蛋白、细胞器结构蛋白、信号转导蛋白、受体蛋白等多种细胞内关键蛋白的相互作用，在维持细胞生长、胚胎发育、细胞分化等方面起着至关重要的作用，其异常表达，与肿瘤的发生、发展关系密切。

1.1 PRMT5 对组蛋白的甲基化作用

有研究发现[9]，PRMT5 通过与人SWI/SNF 染色质重塑复合物的结合，形成PRMT5/SWI/SNF 复合物，通过对称性双甲基化修饰多种肿瘤抑制因子和细胞周期调控基因启动子区域的组蛋白H3 和H4，调控特定靶基因的转录。研究证实，PRMT5 通过催化组蛋白H3 精氨酸8（H3R8）和组蛋白H4 精氨酸3（H4R3）发生对称性双甲基化，能够抑制多种肿瘤抑制基因的表达，如ST7、视网膜母细胞瘤（retin oblastoma, RB）肿瘤抑制基因家族和蛋白酪氨酸磷酸酶受体O 型（protein tyrosine phosphatase receptor-type O, PTPROt）等的表达[10]。在关于胃癌的队列研究中[11]，证实PRMT5 在胃癌患者中高表达，并能协同增加胃癌细胞中肿瘤抑制基因1（iroquois homeobox 1,IRX1）启动子区域的DNA 甲基转移酶3A（DNA methyltransferase 3A, DNMT3A）的募集，当敲除胃癌细胞株中的PRMT5 后，可以显著延缓胃癌细胞的生长并减少胃癌细胞的转移，该研究还发现，无论过表达的PRMT5 是与核小体重塑复合物还是DNA 修饰酶发生相互作用，当沉默PRMT5的表达后，均能够减少肿瘤的发生率并增加肿瘤细胞凋亡率。

在一项对结直肠癌中成纤维细胞衍生生长因子受体3（fibroblast-derved growth factor receptor-3, FGFR-3）和真核伸长起始因子4E（eukaryotic elongation initiation factor 4E, eIF4E）的研究中，发现PRMT5 诱导的H3R8和H4R3 对称性双甲基化可以提高FGFR-3和eIF4E基因的转录水平，当PRMT5 敲除后可以降低H3R8和H4R3 的甲基化水平，以及这2 个基因的表达[12]。同时，DENG 等[13]研究发现，PRMT5 可以激活前列腺癌细胞中雄激素受体（androgen receptor, AR）的表达，PRMT5 可以与转录因子BRG1 和SP1 相互结合，在AR基因的启动子区域催化H4R3 发生对称性的双甲基化，导致AR的转录激活并增强前列腺癌细胞的生长。该研究还发现，PRMT5 的诱导性敲除是以AR依赖性的方式，即抑制AR 阳性前列腺癌细胞以及裸鼠皮下移植瘤的生长，并且使用PRMT5 的特异性抑制剂后，同样可以降低H4R3 的甲基化水平，以及AR阳性前列腺癌细胞中AR 的表达，并延缓前列腺癌细胞的生长。

1.2 PRMT5 对非组蛋白的甲基化作用

PRMT5 除了具有甲基化组蛋白的能力，还能够甲基化某些重要的转录因子，显示出PRMT5 在细胞功能调控中的关键作用。PRMT5 可以甲基化p53并改变其DNA 结合活性，从而调控p53靶基因的表达[14]。PRMT5 也被证明可以甲基化N-MYC，改变其蛋白的稳定性，并增强 其在神经母细胞瘤中的致癌活性[15]。有研究表明[16]，在肿瘤发生、发展中起重要作用的转录因子E2F-1 和NF-κB/p65 同样可以被PRMT5 修饰，该2 个转录因子一旦发生甲基化，可高效诱导靶基因表达。与此同时，PRMT5 的靶蛋白谱不仅仅局限于核转录因子，还包括细胞质蛋白，如高尔基蛋白、核糖体蛋白S10（ribosomal protein S10, RPS10）和快速加速纤维肉瘤（rapidly accelerated fibrosarcoma, RAF）蛋白激酶[5，17]。此外，研究进一步证实PRMT5 可以甲基化凋亡信号调节激酶1（apoptosis signalregulating kinase 1, ASK1）R89 处，并促进PRMT5 与蛋白激酶B（Akt）的结合[18]，发生对称性甲基化的ASK1 与Akt 的相互作用导致其在丝氨酸83 处进一步磷酸化，从而减弱其活性并抑制细胞的凋亡。上述研究表明，PRMT5 除了能够直接调控自身靶基因外，还能够通过催化关键的核转录因子或细胞质蛋白发生对称性双甲基化，间接影响其他基因的表达，从而影响肿瘤细胞的生长、增殖和分化。

2 PRMT5 表达的调控机制

大量研究已经证实，PRMT5 在多种类型的侵袭性肿瘤中高表达，包括B 和T 细胞淋巴瘤[19]、转移性黑色素瘤[20]、神经母细胞瘤和胶质母细胞瘤[21]、生殖细胞瘤[22]、卵巢癌[23]、乳腺癌等[24]。目前关于PRMT5在肿瘤组织中水平改变的机制研究较少，PAL 等[9]的研究表明，miR-92b 和miR-96 的下调是导致不同B 细胞淋巴瘤类型中PRMT5 mRNA 翻译能力增强的原因。此外，在ALINARI 等[10]的研究中发现，PRMT5 可以与NF-κB/p65 和HDAC3 结合后形成复合物，该复合物与miR-96 启动子区域结合并抑制其转录，从而通过负反馈回路调控miR-96 的转录，进而影响PRMT5 自身的表达。这些研究表明肿瘤组织中PRMT5 的高表达，是转录后失调的直接结果，并且PRMT5 可以通过直接抑制特定microRNA 的转录来促进自身的表达。

3 PRMT5 在肿瘤中的作用

3.1 肿瘤细胞转化中的作用

细胞转化是细胞发生遗传性状改变的一种变化，是肿瘤发生的重要原因之一。研究发现PRMT5 的高表达与肿瘤细胞转化关系密切[10，19]。PRMT5 的高表达可以诱导体外永生化NIH3T3 成纤维细胞的转化。研究发现，在细胞和动物水平上抑制PRMT5 的表达后，可以诱导癌细胞生长停滞和死亡[25]。ALINARI 等[10]的研究结果发现，正常B 淋巴细胞感染EBV 后，PRMT5蛋白水平最早在感染后4 ～8 d 升高，但是当诱导PRMT5 高表达后，miR-96 水平下降，PRMT5 直接靶基因（如ST7和PTPROt）水平下降，该研究结果不仅证实PRMT5 和miR-96 间存在负反馈回路的相关性，而且进一步证实PRMT5 与肿瘤细胞转化相关。此外，研究发现[25]，PRMT5 的高表达与G1期细胞周期蛋白Cyclin D1、D2 和E1 的上调，以及细胞周期依赖性激酶（cyclin dependent kinases, CDKs）4 和6 有关，PRMT5 通过激活抑制促凋亡关键基因磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）和促进细胞存活关键基因Akt的表达，促进肿瘤细胞转化，当使用PRMT5 的小分子抑制剂或shRNA 使PRMT5 沉默时，可以恢复miR-96 及其靶基因的表达水平。结果表明，PRMT5在控制细胞转化中起着重要作用，其过度表达可以促进肿瘤细胞的转化。

3.2 PRMT5 对肿瘤增殖信号通路的调节作用

PRMT5 在癌细胞中的高表达与肿瘤抑制基因的转录沉默高度相关[10]。同时有研究发现[26]，PRMT5可以通过高度保守的RB-E2F 途径调控细胞生长，PRMT5 通过直接甲基化RB1、RBL1和RBL2等肿瘤抑制基因的启动子区域的组蛋白H3R8 和H4R3 来调节这一途径，对这些抑癌基因甲基化修饰的结果是3 个肿瘤抑制基因的转录受到抑制，然而，研究发现只有RBL2 在蛋白水平上被抑制，尽管RB1 和RBL1未被翻译抑制，但是其都失去原本的蛋白活性，可能的机制是PRMT5 通过抑制miR-96 来促进Cyclin D-CDK4/6 的激活，RB1 和RBL1 被Cyclin D-CDK4/6激酶复合物的磷酸化而失活[19]。上述研究结果发现，在正常情况下，miR-96 通过抑制Cyclin D 的表达发挥抑制细胞生长的作用，而PRMT5 通过抑制miR-96 的转录来促进Cyclin D-CDK4/6 的激活。

有研究表明，PRMT5 通过甲基化修饰特异性精氨酸残基来直接控制E2F 家族成员（如E2F1）的转录活性[27]，同时也间接通过调控肿瘤抑制因子Rb 家族的磷酸化水平和活性来控制其转录活性[19]。PRMT5 通过抑制肿瘤抑制蛋白Rb 家族的转录，导致E2F1靶基因PRC2亚单位的表达增加，以及PRC2甲基转移酶活性增强，进而通过抑制抗癌基因的转录，包括促凋亡靶基因CASP10、DAP1、HOXA5和HRK，来促进癌细胞的生长和增殖[19]。根据结果，PRMT5 能够通过对靶基因启动子区域组蛋白H3R8 和H4R3 的甲基化，以及通过甲基化修饰包括E2F1 和NF-κB/p65 等关键转录因子的特异性精氨酸残基来促进癌细胞的生长[24]。

有研究发现，PRMTs 虽然可以催化特定蛋白精氨酸的甲基化，但是PRMTs 家族不同成员可以赋予其靶蛋白不同的性质，比如PRMT1 和PRMT5 对E2F1 甲基化作用是互斥的。研究发现[27]，PRMT1 介导E2F1精氨酸109（R109）处发生不对称双甲基化能够增强其转录活性，从而导致在DNA 损伤期间E2F1 促凋亡靶基因的表达增加，但Cyclin A 与E2F1 的结合可以阻碍PRMT1 与E2F1 的结合，并促进PRMT5 催化E2F1 在R111 和R113 处发生对称性双甲基化，发生双甲基化的E2F1 与Tudor 结构域蛋白p100-TSN 结合，后者抑制其凋亡活性并增强其生长刺激功能。因此，根据E2F1 中发生的精氨酸修饰类型的不同，可以出现不同的结果，这进一步证实PRMT5 在防止细胞凋亡和促进细胞增殖中所起的作用。此外，LIM 等[28]通过实验证实PRMT5 能够增强癌基因（如C-MYC和Cyclin D1）的翻译来控制细胞的增殖和存活，该研究表明，PRMT5 不仅可以通过调节eIF4E 的转录增加其蛋白水平，而且可以将eIF4E 招募到C-MYC和Cyclin D1mRNA 的5’帽结合区，以增强C-MYC和Cyclin D1的翻译。总之，结果表明，PRMT5 通过控制关键细胞周期调节基因的转录、翻译和翻译后修饰促进肿瘤细胞的增殖。

3.3 PRMT5 对肿瘤关键蛋白稳定性的调节作用

转录因子Kruppel 样因子4（Kruppel-like factor 4, KLF4）主要参与调控细胞命运和细胞周期的进展[24]，包括控制细胞增殖、维持基因组稳定、凋亡和干细胞更新，改变KLF4 稳定性将间接影响其下游的多个靶基因表达。PRMT5 能够使KLF4 的R374、R376、R377 处发生甲基化，通过VHL/VBC E3 连接酶抑制KLF4 泛素化并增加其稳定性。研究表明[24]，在不同的乳腺癌细胞株中，PRMT5 的敲除或抑制导致KLF4泛素化和失活增加，证实PRMT5 在维持KLF4 蛋白稳定性中起关键作用。此外，该研究还发现，在乳腺癌细胞株MCF-7 中高表达PRMT5 或KLF4 会导致甲基化的KLF4 蛋白在细胞内积累，降低促凋亡基因BAX的转录，从而促进癌细胞生长和存活[24]。同时，乳腺癌基因芯片数据分析表明，在乳腺癌细胞株MCF-10A和MCF-7 中，KLF4 的表达升高可以上调一些癌基因和细胞周期激活因子的转录，如MAPK、EGF/EGFR、IGF1、Cyclin D2、CDK1和Cyclin E1，参与调节肿瘤干细胞更新和转移的其他基因也在KLF4 过度表达的乳腺癌细胞中上调，包括C-MYC、SOX9、BMI1、Z1B1、SLUG、TWIST和N-Cadherin。更重要的是，对临床样本的分析表明，与邻近的正常组织比较，高度侵袭性乳腺肿瘤组织中的PRMT5 和KLF4 细胞水平均升高。PRMT5 作为一种关键的表观遗传调控因子，通过精氨酸甲基化和泛素化之间的相互作用调节肿瘤干细胞关键转录因子的表达，能够通过多种途径促进肿瘤细胞生长和存活。

3.4 PRMT5 对肿瘤干细胞的调节作用

由于PRMT5 对胚胎和成人干细胞增殖和自我更新有重要影响，CHIANG 等[29]关于PRMT5 对肿瘤干细胞功能调节作用的研究发现，在乳腺癌干细胞（breast cancer stem cell, BCSC）中，PRMT5 的表达升高，当敲除PRMT5 后，BCSCs 的体外、体内增殖和自我更新显著降低。此外，对NSG（NOD/Scid/IL-2Rγnull）小鼠接种PRMT5 敲除后BCSCs 的皮下移植瘤的组织病理学分析表明，与对照组比较，PRMT5 的表达降低可以出现分化程度更好和惰性的乳腺癌表型，结果提示PRMT5 对BCSC 的生长和增殖至关重要，靶向抑制PRMT5 可以减少乳腺癌干细胞的数量和抑制肿瘤的生长。同时，进一步研究PRMT5 和转录因子叉头盒样蛋白1（Forkhead box protein 1, FOXP1）之间的关系，发现PRMT5 通过对称性双甲基化H3R2 上调FOXP1 的表达，H3R2 是SET1/MLL 甲基转移酶复合物WDR5 亚基的结合位点。当使用GSK591 抑制剂使PRMT5 失活，或者破坏WDR5 和SET1/MLL 复合物之间的相互作用，都可以导致H3K4 甲基化水平和FOXP1 表达显著降低。该研究结果与FOXP1 基因敲除对乳腺癌细胞体外和异种移植生长的抑制作用结果是一致的，提示PRMT5 的某些促肿瘤特性是通过FOXP1 介导的，同时，进一步表明抑制PRMT5基因的表达是一种可行的治疗肿瘤的方法。

3.5 PRMT5 对程序性细胞死亡蛋白的调节作用

研究表明[30]，程序性细胞死亡蛋白4（programmed cell death 4, PDCD4）是一种肿瘤抑制蛋白，在各种肿瘤中，其高表达水平与患者较高的生存率有关。在乳腺癌细胞株MCF-7 中，PRMT5 与PDCD4 相互结合后，PRMT5 将PDCD4 的R110 处甲基化，PDCD4 失去肿瘤抑制活性，该研究进一步发现，当2 种蛋白中的任何一种发生突变时，都会丧失对肿瘤的促进作用，这表明PRMT5 介导的PDCD4 甲基化对肿瘤的生长是至关重要的。此外，与PDCD4 水平高和PRMT5 水平低的患者相比，PRMT5 和PDCD4 表达水平均升高的患者生存率降低[30]。同时，在各种肿瘤中，已发现PRMT5 水平升高与患者的不良预后相关，在一项随访研究中，进一步证实PRMT5 与PDCD4 的这种相关性[31]，该研究发现，PDCD4 的甲基化促进营养缺乏时肿瘤细胞的存活，并且在PDCD4 磷酸化并转移到细胞核后，该结果在营养恢复后被逆转。以上这些研究表明，PRMT5 的过度表达导致其与促生长蛋白和肿瘤抑制蛋白相互作用发生改变，从而影响其生物学活性，有利于癌细胞的生长、存活和侵袭性。

3.6 PRMT5 对肿瘤代谢的调节作用

目前已知肿瘤细胞可以改变其代谢途径，以促进其快速生长和增殖。PRMT5 除了能够调控肿瘤细胞的增殖和死亡信号通路外，还参与肿瘤细胞脂肪生成的过程，以及高糖浓度下肿瘤细胞G1到S 期检查点的调节。脂肪酸、甘油三酯和磷脂生物合成的基因表达过程受转录因子甾醇调节元件结合蛋白（sterol regulatory element binding protein, SREBP）1a 和c 的严格调控[32]，这2 种转录因子在Hek293 和HepG2 细胞系中均与PRMT5 发生相互作用，PRMT5 与肿瘤细胞脂肪生成增加具有相关性。这种相互作用依赖于PRMT5 的催化活性，PRMT5 对称性双甲基化SREBP1a 上的R321，阻止GSK3 对丝氨酸430 的磷酸化，增加其转录活性，从而促进肝癌细胞的脂肪生成[32]。PRMT5 介导的甲基化不仅可以阻止SREBP1a 的磷酸化，而且可通过蛋白酶体途径抑制SREBP1a 的泛素化和降解。此外，SREBP1c 在HEK293 和HepG2 细胞系中均与PRMT5相互作用，并增强其稳定性，促进肿瘤细胞的脂质代谢和生长。PRMT5 通过稳定SREBP1a 或SREBP1c，在增加肿瘤细胞的脂肪生成中所起重要作用，并表明PRMT5 介导的SREBP 蛋白甲基化过程与肝癌的侵袭性之间有很强的相关性。

有研究表明，肿瘤细胞在转化过程中是利用有氧糖酵解来产生细胞生存所必须的ATP，而不是通过常规的氧化磷酸化过程[33]。肿瘤细胞通过上调ATPase合酶中的ATPase 抑制因子1（ATPase inhibitory factor 1, ATPaseIF1）和下调ATPase 合酶的催化亚基β-F1 ATPase 来实现这种转换。肿瘤细胞对葡萄糖的依赖伴随着促进癌细胞生长的基因变化。研究表明，在高葡萄糖存在下，PRMT5 与细胞周期蛋白依赖激酶4（cyclin dependent kinase 4, CDK4）相互作用，并促进其从CDK抑制剂CDKN2a（p16ink4a）中释放，从而促进肝癌细胞中的G1到S 期的转变[34]。因此，PRMT5 通过甲基化组蛋白或非组蛋白，能够调节对细胞存活和增殖至关重要的代谢途径。

4 总结与展望

PRMT5 已成为多种癌症的重要生物标志物，PRMT5 的致癌作用是由其甲基化组蛋白和非组蛋白的精氨酸实现的，导致下游癌基因和抑癌基因的表达失调，从而使细胞发生恶性转化。越来越多的证据表明，PRMT5 的过表达可以激活增殖信号的转导，促进癌细胞的生长和转移，而抑制PRMT5 的活性或表达后，可以减缓肿瘤细胞的生长并重新激活抑癌基因的表达。由于必须要考虑到PRMT5 对正常发育和分化也是必不可少的，因此，尽管有理由开发行之有效的PRMT5 特异性抑制剂来治疗各种类型的癌症，但应在细胞和动物模型中进行严格的试验，以排除PRMT5抑制可能对胚胎发生、精子发生、器官发育、成人造血和免疫反应等其他重要过程产生的不利影响。未来，通过应用高通量组学技术、新的细胞培养技术和条件性基因敲除动物，更有助于了解PRMT5 功能和在肿瘤发生、发展中的分子机制，可能会开发出对肿瘤预防和治疗更有效的方法。