肉桂精油纳米胶囊制备表征及体外抗菌抗氧化能力

李鑫玲，康怀彬*，张慧芸

1(河南科技大学 食品与生物工程学院，河南 洛阳,471023) 2(食品加工与安全国家级实验教学示范中心，河南 洛阳, 471023)

近年来，随着消费者安全意识的提高，传统芳香植物精油及其生物活性化合物作为合成防腐剂的替代品得到了广泛的研究。精油是具有抗菌、抗炎、镇痛、抗氧化作用的挥发性植物次生代谢产物[1-2]。由于其固有的生物活性、良好的安全性和可生物降解性，大多数已被美国食品药品监督管理局认为是安全的[3-4]，被广泛应用于医药、化妆品和食品工业中[5-7]。肉桂精油是从肉桂叶和树皮中提取的，含有较高的丁香酚和肉桂醛，研究表明其对单核增生李斯特菌、肠沙门氏菌、大肠杆菌等革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有一定的抗菌和抗氧化作用[8]。虽然植物精油具有很好的防腐潜力，但由于其挥发性高、反应性强、水溶性差、分散性不均匀等，会给食品感官品质带来负面影响[3]，此外，精油还对环境氧、温度和光敏感，限制了其作为食品防腐剂的广泛应用。纳米封装技术为保持精油的稳定性，防止挥发性成分的流失提供了有效的途径[9-10]，微胶囊化不仅可以掩盖精油的不良味道和气味，纳米载体还可以保护精油不被酶降解，控制活性物质的释放，具有独特的抗菌性能和较高的表面积/体积比[11]。因此，当精油与纳米粒子等其他强效抗菌药物联合使用时，其固有的抗菌活性可能通过相互补充来对抗不同类型的病原体，从而大大增强其抗菌活性。

几丁质去乙酰化得到的壳聚糖作为第二丰富的多糖，因其无毒、生物降解性和生物相容性，非常适合作为壁材封装精油。此外，壳聚糖还具有抗菌、抗氧化、杀虫和黏结性等广泛的生物活性，在食品和医药领域有广泛的应用前景。国内外壳聚糖纳米胶囊常用的制备方法有离子凝胶法、共价偶联法、大分子复合法和自组装法等。其中离子凝胶法制备工艺简单便捷、反应条件温和、纳米粒子粒径均匀性质稳定[12]，近年来国内外对微胶囊化植物精油方面研究较多，但对于肉桂精油纳米胶囊化并对其物理性质及体外抗菌抗氧化能力进行系统研究的却鲜有报道。本文采用离子凝胶化结合超声波法制备了以壳聚糖为壁材的肉桂精油纳米胶囊，研究壳聚糖与三聚磷酸钠(tripolyphosphate, TPP)的质量比、肉桂精油(cinnamon essential oil, CIEO)与壳聚糖质量比及pH值对肉桂精油纳米胶囊的粒径和ζ-电势的影响。通过拉曼光谱、粒径分析仪等对其形貌和结构进行了表征，并对其体外抗菌抗氧化能力进行系统研究，为开发新型防腐剂提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

壳聚糖(脱乙酰度95%)，上海蓝季生物试剂有限公司；肉桂精油，国药集团化学试剂有限公司；吐温-80，分析纯，天津市德恩化学试剂有限公司；多聚磷酸钠，分析纯，天津市津北精细化工有限公司；肉桂醛标准品，上海源叶生物科技有限公司；冰醋酸，分析纯，江苏强盛功能化学股份有限公司；

1.2 仪器与设备

H2050R台式高速大容量冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；MS2000型激光粒度仪，英国马尔文仪器有限公司；Zeta Sizer-2000型Zeta电位测定仪，英国Malvern公司。TM3030Plus型扫描电镜，日本日立公司；XPLORA ONE 785nm激光拉曼光谱仪，法国HORIBA公司,UV-2450PC型紫外-可见光分光光度计，85-2型日本岛津公司恒温磁力搅拌器，常州越新仪器制造有限公司；PHS-3C台式pH计，上海精科有限公司。

1.3 肉桂精油纳米胶囊的制备

采用离子凝胶结合超声波法制备肉桂精油纳米胶囊[13]。以1%(体积分数)冰醋酸为溶剂配置5 mg/mL壳聚糖溶液，经1 h超声水浴后，微孔过滤，调节滤液pH值至5.0。将80 mg吐温-80逐滴添加到加至50 mL的上述壳聚糖滤液中，在60 ℃条件下搅拌30 min得到均匀混合物。取72 mg肉桂精油溶于4 mL无水乙醇，随后逐滴加入到冷却的壳聚糖溶液中，常温搅拌30 min，壳聚糖/精油的质量比为1∶1、0.8∶1，在1 200 r/min条件下搅拌20 min。混合物中加入取30 mL TPP水溶液形成O/W乳液，1 000 r/min持续搅拌 50 min，形成肉桂精油纳米胶囊。

1.4 肉桂精油纳米胶囊的表征

1.4.1 粒径大小和ζ-电势

以纯净水为背景，将样品胶囊均匀分散至水溶液中，控制其浓度在可测试范围内，通过激光粒度分析仪测定胶囊的粒径大小及分布状况。采用ζ电位测定仪测定纳米胶囊ζ-电势。

1.4.2 扫描电镜观察

将样品溶液均匀涂在黑色导电胶上，风干，进样，在冻干条件下对纳米胶囊的形态进行观察[14]。

1.4.3 拉曼光谱测定

参照SHAO等[15]方法，稍有改动。拉曼光谱激光波长785 nm，功率50 mW，仪器采用单晶珪对频率进行校正，动波长扫描3次，积分时间20 s，检测范围400～2 000 cm-1，每个样品测试3次。

1.5 包埋率和累积释放率的测定

参照HU等[16]的方法，测定肉桂精油纳米胶囊的包埋率和累积释放率。

精油包埋率计算公式如公式(1)所示：

(1)

式中：E,包埋率，%；M0,初始精油量，mg；Mn,微胶囊中精油总质量，mg。

样品分散液在4 ℃，9 000 r/min下离心5 min，以分离出肉桂精油纳米胶囊，以5 mL醋酸盐缓冲溶液(pH 5)将其悬浮，混合物在200 r/min旋涡振荡。在不同的时间间隔取样，以9 000 r/min离心5 min，然后取出一定体积的上清液加入等体积缓冲溶液，采用紫外分光光度计测定285 nm下的上清液中释放出的肉桂精油的量。

精油累积释放量计算公式如公式(2)所示：

(2)

式中：Mt,某时刻肉桂精油释放量;M0,最初纳米胶囊中精油负载量。

1.6 体外抗菌抗氧化性能测定

1.6.1 体外抗菌抗性能

采用抑菌圈法[17]测定了壳聚糖纳米胶囊(chitosan nanocapsules, CS-NPs)、CIEO、CIEO- NPs对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的抗菌活性。菌株在37 ℃条件下，营养琼脂培养皿中过夜培养。将培养皿中的营养琼脂培养基接种0.1 mL对应菌。无菌滤纸片(直径6 mm)分别浸渍CIEO-NPs和CS-NPs水分散液1 mL(0.2 g/mL)，紫外灯下干燥5 min，以CS-NPs为对照。每个培养皿无菌滤纸片周围抑菌圈的直径作为衡量其抗菌活性的指标,每次实验重复6次。

1.6.2 体外抗氧化性能测定[18]

将制备好的纳米胶囊定量分散于4 mL DPPH乙醇溶液(0.05 mmol/L)中，振荡反应2 h，将反应后的混合液离心，在517 nm处测定上清液的吸光度值。抑制率计算公式如公式(3)所示：

(3)

式中:A0，未检测样品的DPPH溶液在517 nm处的吸光度;AS，DPPH与待测样反应后上清液的吸光度。

1.7 数据统计分析

实验数据采用SPSS 19.0软件进行显著性分析(P<0.05)，用Origin 8.0绘图。

2 结果与讨论

2.1 壳聚糖与TPP的质量比对肉桂精油纳米胶囊的粒径和ζ-电势的影响

如图1所示，随着CS/TPP质量比的增加，肉桂精油纳米胶囊的粒径逐渐增大然后趋于平缓，XIAO等[19]的研究表明CS含量越高，CS-NPs的粒径越大，与本研究结果相一致。由于CS浓度的增加，使得CS与TPP的之间很容易发生离子凝胶反应。随着CS带正电荷氨基基团的增强，CIEO-NPs之间的静电斥力增强，有效地维持了其稳定性[20-21]。此外，随着CS/TPP质量比的增加，CIEO-NPs的ζ-电势呈先增大后降低的趋势。这是由于正电荷越多的CS分子在CIEO-NPs表面产生更多游离氨基，当CS/TPP质量比为7∶1时，壳聚糖分子几乎被完全交联，当CS/TPP质量比继续增加，纳米粒子表面电荷降低，不能保持较大粒子的稳定性，便造成了粒子絮凝。

图1 CS与TPP质量比对肉桂精油纳米胶囊粒径和ζ-电势的影响Fig.1 Effects of mass ratio of CS to TPP on particle size and ζ-potential of CIEO-NPs

2.2 肉桂精油与壳聚糖质量比对肉桂精油纳米胶囊的粒径和ζ-电势的影响

不同肉桂精油与CS质量比对CIEO-NPs粒径和ζ-电势的影响如图2所示。

图2 肉桂精油与CS质量比对肉桂精油纳米胶囊粒径和ζ-电势的影响Fig.2 Effects of mass ratio of CIEO to CS on particle size and ζ-potential of CIEO-NPs

随肉桂精油质量的增加，CIEO-NPs的粒径逐渐增大，ζ-电势呈先上升后下降的趋势，在质量比为0.8∶1时，ζ-电势达到峰值，为35.8 mV。当肉桂精油添加量较少时，以细小的液滴状均匀地分散在溶液中，CS可以完全封装分散的肉桂精油液滴。随着精油添加量的增加，CIEO- NPs的粒径增大，但其ζ-电势减小，由于更多的CIEO溶解在胶束中，CIEO-NPs的粒径继续增大。此外，过量的精油将黏附在CIEO-NPs表面，会降低纳米胶囊的表面电荷，进而导致其聚集，ζ-电势减小。JOHN等[22]研究结果表明，一般当纳米粒子的ζ-电势绝对值大于30 mV时，其处于稳定的状态，不易发生凝聚。因此选择CIEO/CS质量比为0.8∶1。

2.3 pH值对CEO-NPs的粒径和ζ-电势的影响

pH值对纳米胶囊粒径和ζ-电势的影响如图3所示。壳聚糖是一种碱性多糖，在中性或碱性条件不溶解[23]。壳聚糖的质子化程度与溶液的pH值密切相关，纳米胶囊的形成依赖于带正电荷的CS与带负电荷的TPP的相互作用[24]。因此，pH值对纳米胶囊的粒径和ζ-电势都有显著影响。随着pH值的增加，CS分子质子化程度降低，ζ-电势也不断下降。pH值还可以影响纳米胶囊的离子交联过程[25]，当pH<5时，纳米胶囊粒径逐渐减小，而当pH>5时，粒径大小随着pH值的增加而增大。当pH值较低时，CS与TPP离子间的交联反应易于进行；而当pH值过大时，不利于离子交联反应的发生，便导致了CIEO- NPs的聚集。因此，制备选择条件pH值为5。

图3 pH值对肉桂精油-壳聚糖纳米胶囊粒径以及ζ-电势的影响Fig.3 Effect of pH value of CS solution on particle size and ζ-potential of CIEO-NPs

2.4 肉桂精油纳米胶囊的粒径分布及形态观察

图4、图5和图6分别显示了肉桂精油纳米胶囊的粒径分布及扫描电镜、显微镜图。由图4可知，肉桂精油纳米胶囊的平均粒径为178 nm，粒径分布较窄，呈单分散性。由扫描电镜(图5)及显微镜图(图6)可以看出肉桂精油纳米胶囊呈球形，较少有团聚，与粒径分析结果一致。由此可以看出，制得的肉桂精油纳米胶囊具有较高的均一性。

图4 肉桂精油纳米胶囊与空白壳聚糖纳米胶囊的粒径分布Fig.4 Particle size distribution of cinnamon essential oil-loaded chitosan nanocapsule

图5 肉桂精油纳米胶囊的扫描电镜图Fig.5 SEM of cinnamon essential oil-loaded chitosan nanocapsule

图6 肉桂精油纳米胶囊的显微镜图Fig.6 Microscope image of cinnamon essential oil-loaded chitosan nanocapsule

2.5 肉桂精油纳米胶囊的包埋率和体外释放

紫外可见分光光度计结果可知肉桂精油纳米胶囊的包埋率为42.58%，高于WANG和XIAO[26]报道的壳聚糖负载肉桂精油纳米胶囊的包埋率。图7为肉桂精油纳米胶囊在醋酸缓冲液中的释放曲线。肉桂精油的释放曲线呈起始的突释阶段，随后进入平稳的释放延滞期，最终达到平稳期。从90 h的累积释放结果可以看出，在最初的12 h内肉桂精油完成了突释，精油的累积释放率达到52.84%，这主要是由于大量不稳定的结合在纳米胶囊表面的精油瞬时扩散导致的。随后累积释放量缓慢增加,释放速率逐渐降低，60 h后趋于稳定，累积释放率上升至61.53%，这主要是由于壳聚糖与TPP分子间的交联作用减弱，纳米胶囊逐渐降解和精油在纳米胶囊中扩散作用导致的。90 h后，精油的累积释放率达到62.50%，缓释作用明显。

图7 肉桂精油纳米胶囊的释放曲线(pH 5.0)Fig.7 Release curve of cinnamon essential oil nanocapsule at pH 5.0

2.6 肉桂精油纳米胶囊的拉曼光谱分析

图8 壳聚糖(a)，壳聚糖空白胶囊(b)，肉桂精油(c)，肉桂精油纳米胶囊(d)拉曼光谱Fig.8 Raman spectum of CS(a)， CS blank capsules(b) and cinnamon essential oil-loaded chitosan nanocapsules(c)

2.7 体外抗菌性能测定

采用抑菌圈法测定肉桂精油纳米胶囊对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抗菌效果。抑菌圈大小与样品的抑菌活性有关，抑菌圈越大表明抑菌效果越强，抗菌活性越高。如表1所示，经过1 d的培养，空白胶囊、肉桂精油和肉桂精油纳米胶囊均产生了明显的抑菌圈，其中肉桂精油纳米胶囊的抑菌效果最好(P<0.05)。CIEO-NPs对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用大于枯草芽孢杆菌。肉桂精油中的许多芳香成分如肉桂醛对多种细菌均表现出良好的抗菌活性活性[30]，肉桂醛具有破坏和穿透细菌细胞壁脂质结构的能力，可以破坏细胞膜，使离子及其他细胞质渗漏，最终导致细胞裂解死亡[31]。同时，壳聚糖本身具有一定的抗菌活性[32]，因此，在肉桂精油和壳聚糖的协同作用下，CIEO-NPs的抗菌作用增强。EI-BAROTY等[33]的研究表明肉桂醛对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有抑制作用，这与本研究结论相似。

表1 肉桂精油纳米胶囊对不同菌的抑制作用 单位：mmTable 1 Antibacterial activity of cinnamon essential oil nanocapsules on different bacterium

注：同一列肩标字母(a-c)不同，表示不同处理差异显著(P<0.05)。

2.8 体外抗氧化性能测定

自由基清除能力是筛选抗氧化活性物质普遍采用的一种常用方法[34]，从图9可以看出，肉桂精油纳米胶囊的自由基清除活性明显优于单独的肉桂精油，并且随着质量浓度的增加，肉桂精油的自由基清除活性显著增强；而作为对照，壳聚糖纳米胶囊几乎没有清除自由基的能力。有报道称，肉桂油具有较高的DPPH自由基清除活性，与合成抗氧化剂作用相似[35]，虽然有研究报道壳聚糖纳米颗粒的抗氧化性能有限[36]，但在肉桂精油与壳聚糖的协同作用下，肉桂精油纳米胶囊DPPH自由基清除能力显著提高，抗氧化活性明显增加。

图9 肉桂精油纳米胶囊对DPPH的清除效果Fig.9 Scavenging activity of cinnamon essential oils nanocapsules on DPPH radical

3 结论

本研究通过离子凝胶化反应制备了粒径为178 nm、ζ-电势为33.72 mV的肉桂精油纳米胶囊。CIEO-NPs的粒径大小和ζ-电位与CS与TPP的质量比、CS与精油的质量比及pH值有很强的相关性。紫外光谱显示肉桂精油90 h后的累积释放量达到62.50%，说明CIEO-NPs具有良好的缓释性能。此外，CIEO-NPs对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌具有显著的抗菌活性；自由基清除实验表明CIEO-NPs具有较高的DPPH自由基清除活性。总之，本研究制备的CIEO-NPs具有较高的体外抗菌和抗氧化活性，可以作为一种潜在的天然抗菌抗氧化剂在食品和医药领域中应用；同时为进一步系统研究CIEO-NPs物理性质及体外抗菌抗氧化能力提供理论基础。